ELISA实验抗原的摄取与抗血清的制备

ELISA实验抗原的摄取

（1） 抗原的摄取 任何血清学试验都依赖于具有高效价、特异性强的抗血清的产生，而抗血清的制备离不开抗原的收集、保存和提取。采回的害虫饥饿24h后，将等体积的磷酸缓冲液（PBS）滴入备用的害虫中，研磨后加入过量的PBS（PH=7.4）,在4℃下搅拌24h,然后以4000-5000r/min的速度离心20h,分离上清液。沉渣用上法重复抽提一次。

将两次所得的上清液混合后，置于4℃下更换多次冷盐水透析24h或48h。透析液用冰冻干燥法或反透析法进行浓缩。浓缩液用紫外分光光度计测定蛋白质含量，得到适当浓度的蛋白质溶液即位抗原。

抽提过程中应注意：①所有的处理都需在低温（4℃）下进行，以防蛋白质变性：②若抗原溶液需保存较长的时间，则需加防腐剂（如NaN3）或在冻干状态下保存：③为制备特异性强的抗血清，抗原可用标准的生化技术进行纯化：④如一次不能收集足够的抗原，可将每次的虫体保存在-20℃或将抗原冻干直到积累足够的量。

（2）抗血清的制备

① 所需的抗原量 一般1-10mg/mL。

②免疫途径 抗原的注射方法有皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、静脉注射和淋巴结注射等。其中以静脉注射最为简单方便，不需要佐剂乳化，产生抗体的高峰值出现较早，一般在一周左右，注射后一周即可采血测试效价。免疫过程中应注意：a.佐剂只能现配现用：b.采血时间不宜拖得太长。因为免疫时间越长，产生交叉反应的抗体也越多。

③抗血清的分离 当得到满意的效价时，即可进行取血。将收集到的血液成斜面放置在37℃、温箱中2h。然后置于4℃冰箱过一夜。次日用滴管吸取抗血清，用离心法（2000-3000r/min,20min）去掉沉淀。然后测定效价、鉴定纯度。纯度用紫外分光光度计或Folin氏比色法进行测定。抗血清保存于-25℃低温处。

④抗血清的效价测定 测定的方法一般有两种，即试管沉淀法和免疫双扩散法。对于免疫酶技术使用的抗血清，必须具有一定的效价，试管沉淀法应不低于1:2，免疫双扩散法不低于1:2，且要求单价抗血清。

（3）捕食者的收集和准备 主要方法有3个：①将胃内含物挤在质量好的滤纸上，但蛋白质易与纤维素结合，若保存过久则难以洗脱：②将待检查的捕食封闭在明胶胶囊内，并加干燥剂，以使虫体与胶囊分离：③尽可能快地将采集到的捕食者储存于低温下（如-40℃）。前两种方法适于邮寄和长途运输，后一种方法能保存较长的时间。所有的方法都需保持干燥。对较大的捕食者，可将消化道分离，像蚁、蜗牛以及蜘蛛等小型动物则整个虫体。（4）酶联抗体的制备 按戊二醛简易法进行。

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