体内细胞导人基因的研究

组织培养技术在体外培养细胞的转化和DNA转导等技术中得到应用。人工诱发体外培养细胞的转化，是研究癌变机制的重要方法。其优点是可用于研究各种致癌因素的转化细胞的作用，且能够直接进行观察和分析。在细胞培养条件下，可以用人工方法诱发癌变，而且重复性好，从而构建体外癌变模型，同时亦可用于检测环境中致癌物，是国内外研究致癌机制中普遍应用的技术。

DNA转导或导人技术是把外源DNA或目的基因导入细胞内的技术，已成为当今研究基因的重要方法。在体外培养细胞基因导入的基础上，已有向体内细胞导人基因的研究，则可能成为基因治疗的重要手段之一。

(一)细胞转化

细胞转化是细胞发生遗传性改变的一种变化，涉及基因的改变。细胞发生转化后的性状可以代代相传，能够长期维持和存在。但细胞转化或基因突变不一定就是癌变。因此细胞转化分为一般转化和恶性转化两种。转化分自发转化和人工诱发转化。

1．细胞自发转化是在未用任何诱变剂处理的情况下，细胞自发出现的转化现象，实质上它是一种原因不明的转化现象。初代培养细胞在良好的培养条件下呈二倍体核型，如冻存或传代次数不多的情况下，细胞仍能继续维持二倍体性状。但若长期反复传代，在某些难以控制的因素如营养液或血清质量不佳、微生物污染、温度和pH不稳等影响下，’有可能发生自发转化。自发转化的表现为：细胞核型异倍化、获得永生性、接触抑制消失等。

2．人丁诱发细胞恶性转化在细胞培养条件下，用化学、物理和生物等各种致癌因素，均可人为地诱发细胞发生转化。从细胞直接受到致癌物的作用到细胞发生恶性转化，一般需0．5～3个月。体外人丁诱发细胞转化，对研究癌变机制和检测环境中可疑致癌因素等有很大的实用价值。

常用于细胞转化的细胞有原代细胞和传代细胞。原代细胞多用动物或人成纤维细胞；C3H10Tl／2、3T3一swiss、BALB／3T3、BHK一21、NIH3T3、Rat一1、PC一12等为传代细胞。

凡能改变DNA(基因)结构的因素都可能成为诱发细胞转化凶素。包括：①化学因素：常用有MNNG等。②物理因素：射线，包括阴极射线、放射性核素等。③病毒：SV40、逆转录病毒等。④癌基因：大多癌基因均有使细胞发生转化的能力，但癌基因的转化必须借助载体向细胞中转导技术，来诱导细胞发生转化。

检测细胞是否发生转化常从以下几方面观察：①细胞生物学性状：包括细胞形态、生长速度、倍增时间等。②细胞遗传学特征：包括核型分析、染色体组型、畸变和标记染色体等。③恶性转化测试：浸润性试验、细胞永久性增生试验、异体动物接种成瘤实验等。

(二)细胞凋亡的研究

细胞在体内外因素促发下激活细胞预存的死亡程序而导致死亡，称为凋亡(apoptosis)。细胞凋亡在维持生理稳定以及免疫防御起到重要作用。不同内外因素可通过不同途径，激活细胞凋亡相关蛋白和酶合成释放，使染色体被切割成180～200bp倍数大小片段，细胞膜内陷包裹DN段形成凋亡特征性的凋亡小体。从光镜下、电镜下形态特征及DNA梯形电泳图等都具有凋亡特征性改变，与正常细胞、坏死细胞不同，对研究肿瘤、自身免疫病等疾病发生机制及筛选药物很有研究意义。

(三)DNA转导技术

把基因导人细胞中的技术称为基因转导(gene transfer)。通过基因导人细胞，可使外源基因整合人受体细胞基因组中，是研究基因表达、结构和功能的技术方法。培养细胞是基因转导最适宜的对象。基因转导，尤其是检测癌基因，更为常用。

基因转导技术的种类很多。基因转导可在染色体和DNA大分子(基因)两个水平上进行。①染色体基因转导是利用细胞融合或显微注射法把携有目的基因的染色体或染色体片段，整合入受体细胞内的技术。②基因转导是把已克隆的基因、含有目的基因的DN段或基因序列等，转导入受体细胞基因组中的技术。根据受体细胞的不同，基因转导分成两大类：一类是把基因转导人体外培养细胞中，观察目的基因在体外细胞中的表达，这一技术亦称基因转染(gene transfection)。以体细胞为基因导人对象时，一般用培养细胞，但也可用体内二倍体细胞。如用体内细胞，需要先从体内取出细胞，导人基因后，再输回体内；体内细胞基因导人已成为基因治疗技术之一。另一类受体细胞是受精卵，向受精卵内导入目的基因后，再把受精卵置人宿主动物子宫、发育成个体；可在胚胎期检测目的基因表达，也可于生后再进一步观察目的基因在整体内的表达，此技术称为转基因技术(transgenic technique)。基因转导的具体技术方法当前有：磷酸钙法、脂质体介导法、电击法、显微注入法、病毒载体介导法和DEAE葡糖法等多种。

(四)基因诊断和基因治疗技术中的应用

基因诊断技术随着生物技术的发展而逐步完善起来，已广泛应用于临床研究和诊断。这一技术的关键首先需要从细胞中分离足够量的DNA和目的基凶，再进行标记制备特异基因探针，进而利用核酸杂交(nucleotide hybridization)及聚合酶链反应技(polymerase chain reaction，PCR)来检测致病基因。在基因诊断实验过程中也有细胞培养技术的应用。

当今一些同遗传因素密切相关的人类遗传性疾病也是严重威胁人类健康的因素。随着生物技术的发展，研究者们致力于基因治疗的方法，是对患者采用基因导人等方法来改变或修饰致病基因，达到治疗的目的。基因治疗的方法研究也较多，如原位修复缺陷基因，使其在质和量上均能得到正常表达；正常基因替代缺陷基因；重新开放已关闭的基因，治疗B地中海贫血症就是通过去甲基化使已关闭的7球蛋白基因重新开放．合成Hb F(a2γ2)，以代替Hb A(a2β2)，达到治疗目的；导人抑癌基因(如pRB、p53)基因以抑制癌基因，目的在于阻断有害基因的表达；基因封闭即反义RNA，能封闭mRNA，抑制基因的表达；引人特定基因以提高免疫力：如向细胞内导入TNF、IL一2、IL一4、γ一干扰素等基因，用以提高细胞免疫力，加强细胞杀伤肿瘤细胞的能力。

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