用荧光素标记抗体需注意哪些

目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素或罗达明。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。在检测时要注意一些细节。

用荧光素标记抗体需注意：
1.影响标记的因素主要有温度、时间、pH及荧光素与抗体蛋白的量等。标记所需的时间与温度呈反比，4℃需12-18h，20-25℃需2-4h；PH低，标记慢，但如pH大于10，抗体易变性，故pH以9.0-9.5为宜；抗体蛋白量低标记慢，以20mg/ml为宜；荧光素如使用FITC无定型粉末时，用量可稍大，如为结晶型，用量则应减少。
2.标记抗体中如存在2×10-5 mg/ml游离荧光素时即可产生非特异性荧光，故用Sephadex凝胶柱过滤时，上样量不宜太多，一般上样量小于柱床容积的1/2。
3.免疫血清中的白蛋白易与荧光素结合，在每ml抗体溶液中白蛋白量为6.25×10-2mg/ml时，即可出现非特异性荧光。故待标记的抗体以用纯化的抗体为好。
4.半透膜法（Clark 法）适用于小量抗体的标记。标记效果比直接法均匀，非特异性染色较少，结合物中游离荧光素含量较低，易于彻底去除，但该法荧光素用量较大。仪器，仪表，仪器论坛，仪器供求信息，仪器资讯，仪器技术论坛，仪器资料论坛，仪表论坛，仪器仪表论坛" W& d" H- R5 \- c
5.用过的Sephadex凝胶柱常附有荧光素而难于除尽，可使用0.1mol/L HCl处理0.5h，再依次用蒸馏水、PBS流洗，平衡。

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