蛋白质组实验流程的样品制备原则

样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响2-DE结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。

样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条，这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。

因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。目前有很多方法适于2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等）。

一、细胞样品

1. 细胞培养，加药与处理。

2. 胰酶消化贴壁细胞，PBS漂洗3次(1500ｇ，5min)，弃上清, 再次离心，去尽残液（非常重要！）。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收获细胞。如用10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替PBS，可有效降低样品的盐浓度。

加入5倍体积裂解液，混匀（或将1×106细胞悬于60～100µl裂解液中）。

3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml Dnase，在4℃放置15分钟。

4. 15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。

5. 收集上清。

6. 测定蛋白浓度(采用BioRad RC/DC protein assay kit)。

7. 分装样品，冻存于－70℃。

二、组织样品

1. 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。

2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分钟。

4. 15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。

5. 收集上清，测定蛋白浓度。

6. 分装样品，冻存于－70℃。

注意事项：

1. 8 mmol/L PMSF必须在添加还原剂之前用，否則PMSF会失去活性。

2. 40 mmol/L浓度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH值下失活。

3. 细胞清洗――大多用PBS，若PBS残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹，则可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此问题。