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细胞毒功能的测定
点击次数：182 发布时间：2015/11/16 14:20:27
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黄*
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T淋巴细胞是一个复杂的不均一的群体，根据其发育的不同阶段、表面标志物及功能的不同可分为若干亚群，他们在特异性免疫应答中起着关键性作用。T细胞不仅介导细胞免疫而且对B细胞介导的体液免疫也起着重要的辅助和调节作用。T细胞通过不同的膜表面分子及其分泌的各种细胞因子参与和调节免疫应答。
(一)细胞毒功能的测定
T细胞克隆的杀伤能力多采用51Cr释放试验来衡量。根据克隆的抗原特异性和不同实验目的，可选择携带特异性抗原的细胞或无关细胞作为靶细胞，后者采用NK敏感的K562细胞或NK不敏感的H7402细胞。
1．特异性靶细胞的制备此类抗原多为胞内致病微生物如病毒、原虫及胞内感染菌等．将特异性抗原和无关抗原分别与自体或异体抗原易感细胞共同孵育，时间在数小时至12h。
2．1×106／0．4ml靶细胞加入100μci51Cr，5％C02 37℃培养2h。
3．靶细胞洗3遍，按不同效靶比与克隆细胞混合后37℃培养4h(靶细胞为5×103／孔，另设靶细胞对照孔。
4．吸取上清液测定cpm值，根据相应公式计算出细胞毒活性。
(二)辅助功能的测定
主要观察对自体B细胞的增殖和特异性抗体产生的辅助能力。常将放射后去增殖活性的克隆T细胞与自体B细胞、特异性抗原、饲养细胞共同培养后，以3 H-TdR掺人试验观察B细胞的增殖情况，取培养上清液测定特异性抗体的产生量。
1.辅助B细胞增殖实验
(1)用E花结沉降分离法分离人T和B细胞。
(2)将40Gy照射的抗原特异性T克隆细胞或无关T克隆细胞1×104／孔；自体B细胞5×104／孔及40Gy照射的自体PBMC 5×104／孔在适量目的抗原存在时共同培养，每孔完全细胞培养液总量为200μl。
(3)5％CO237℃培养7d，培养终止前24h加入1μl3H-TdR／孔。
(4)测定样本cpm值，比较抗原特异性T克隆细胞和无关T克隆细胞对自体B细胞照射的影响程度。
2．辅助特异性抗体产生实验
(1)用E花结沉降分离法分离人T和B细胞。
(2)将40Gy照射的抗原特异性T克隆细胞或无关T克隆细胞1×104／孔；白体B细胞5×104／孔及40Gy照射的自体PBMC 5×104／孔在适量目的抗原存在时共同培养，每孔完全细胞培养液总量为200μl。
(3)5％CO2 37℃培养3d，将细胞洗涤3次后以完全细胞培养液悬浮后继续培养7d。
(4)收集上清液，测定上清液中特异性抗体的含量。比较抗原特异性T克隆细胞和无关T克隆细胞对自体B细胞特异性抗体产生的影响程度。
(三)细胞因子分泌功能的测定
可利用不同的诱导剂如相应抗原、抗CD3抗体、PHA等刺激克隆细胞，收集上清液后测定产生的各种细胞因子。
1．末次饲养细胞经PHA刺激后10～15d为理想的测定时间，此时饲养细胞基本死亡，而克隆细胞也不再自发产生细胞因子。
2．取克隆细胞，充分洗涤后以5×104／孔加入96孔U型培养板上，并添加40Gy照射的自体PBMC l×lO5／孔作为抗原递呈细胞，另设不加诱导剂孔为对照。
3．5％CO2 37℃培养，分别于24h、48h、72h等不同时间收集上清液，无菌一20℃保存。
4．用生物活性法或ELISA法测定各因子浓度。
(一)细胞毒功能的测定
T细胞克隆的杀伤能力多采用51Cr释放试验来衡量。根据克隆的抗原特异性和不同实验目的，可选择携带特异性抗原的细胞或无关细胞作为靶细胞，后者采用NK敏感的K562细胞或NK不敏感的H7402细胞。
1．特异性靶细胞的制备此类抗原多为胞内致病微生物如病毒、原虫及胞内感染菌等．将特异性抗原和无关抗原分别与自体或异体抗原易感细胞共同孵育，时间在数小时至12h。
2．1×106／0．4ml靶细胞加入100μci51Cr，5％C02 37℃培养2h。
3．靶细胞洗3遍，按不同效靶比与克隆细胞混合后37℃培养4h(靶细胞为5×103／孔，另设靶细胞对照孔。
4．吸取上清液测定cpm值，根据相应公式计算出细胞毒活性。
(二)辅助功能的测定
主要观察对自体B细胞的增殖和特异性抗体产生的辅助能力。常将放射后去增殖活性的克隆T细胞与自体B细胞、特异性抗原、饲养细胞共同培养后，以3 H-TdR掺人试验观察B细胞的增殖情况，取培养上清液测定特异性抗体的产生量。
1.辅助B细胞增殖实验
(1)用E花结沉降分离法分离人T和B细胞。
(2)将40Gy照射的抗原特异性T克隆细胞或无关T克隆细胞1×104／孔；自体B细胞5×104／孔及40Gy照射的自体PBMC 5×104／孔在适量目的抗原存在时共同培养，每孔完全细胞培养液总量为200μl。
(3)5％CO237℃培养7d，培养终止前24h加入1μl3H-TdR／孔。
(4)测定样本cpm值，比较抗原特异性T克隆细胞和无关T克隆细胞对自体B细胞照射的影响程度。
2．辅助特异性抗体产生实验
(1)用E花结沉降分离法分离人T和B细胞。
(2)将40Gy照射的抗原特异性T克隆细胞或无关T克隆细胞1×104／孔；白体B细胞5×104／孔及40Gy照射的自体PBMC 5×104／孔在适量目的抗原存在时共同培养，每孔完全细胞培养液总量为200μl。
(3)5％CO2 37℃培养3d，将细胞洗涤3次后以完全细胞培养液悬浮后继续培养7d。
(4)收集上清液，测定上清液中特异性抗体的含量。比较抗原特异性T克隆细胞和无关T克隆细胞对自体B细胞特异性抗体产生的影响程度。
(三)细胞因子分泌功能的测定
可利用不同的诱导剂如相应抗原、抗CD3抗体、PHA等刺激克隆细胞，收集上清液后测定产生的各种细胞因子。
1．末次饲养细胞经PHA刺激后10～15d为理想的测定时间，此时饲养细胞基本死亡，而克隆细胞也不再自发产生细胞因子。
2．取克隆细胞，充分洗涤后以5×104／孔加入96孔U型培养板上，并添加40Gy照射的自体PBMC l×lO5／孔作为抗原递呈细胞，另设不加诱导剂孔为对照。
3．5％CO2 37℃培养，分别于24h、48h、72h等不同时间收集上清液，无菌一20℃保存。
4．用生物活性法或ELISA法测定各因子浓度。
原创作者：上海一研生物科技有限公司
