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蛋白质纯化亲和层析法方法步骤
点击次数：1872 发布时间：2015/3/3 9:54:50
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黄*
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蛋白质纯化亲和层析法方法步骤
仪器设备：
亲和层析管柱 （Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm）
部分收集器 （另需准备干净试管约25 支）
药品试剂：
金属螯合亲和层析胶体 （Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210） 1 mL
#在交联琼脂糖凝胶上接有nitrilotriacetic acid （NTA） 官能基，可以螯合镍离子；使用前先以镍离子饱和的。
Buffer B-300/0 （50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl）
#使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol.
Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole
Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole
方法步骤：
1、亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，准备注入样本。
2、 除去胶面上方的缓冲液，并取出样本 （IEX） 使其回到室温，慢慢用滴管加到亲和胶体上，小心勿弄乱胶体表面；让样本没入胶体中，同时收集流出液每管2.5 mL.
3、待样本全部进入胶体后，关闭出口，再慢慢加入buffer B-300/20,打开出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL.
4、接着以buffer B-300/250 流洗30 mL,方法同上，收集。
5、所有收集均定量蛋白质并测定酶活性，取收集酶活性最高的数个，共得 多少mL （AF），保留100 μL 以供分析。
仪器设备：
亲和层析管柱 （Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm）
部分收集器 （另需准备干净试管约25 支）
药品试剂：
金属螯合亲和层析胶体 （Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210） 1 mL
#在交联琼脂糖凝胶上接有nitrilotriacetic acid （NTA） 官能基，可以螯合镍离子；使用前先以镍离子饱和的。
Buffer B-300/0 （50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl）
#使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol.
Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole
Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole
方法步骤：
1、亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，准备注入样本。
2、 除去胶面上方的缓冲液，并取出样本 （IEX） 使其回到室温，慢慢用滴管加到亲和胶体上，小心勿弄乱胶体表面；让样本没入胶体中，同时收集流出液每管2.5 mL.
3、待样本全部进入胶体后，关闭出口，再慢慢加入buffer B-300/20,打开出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL.
4、接着以buffer B-300/250 流洗30 mL,方法同上，收集。
5、所有收集均定量蛋白质并测定酶活性，取收集酶活性最高的数个，共得 多少mL （AF），保留100 μL 以供分析。
原创作者：上海一研生物科技有限公司
