生物实验中动物肝脏DNA的提取与纯化的方法

方法

1、DNA的提取：

a.称取新鲜动物的肝脏（如猪肝）约10g，于研钵中，在冰浴中剪碎，加2倍组织重的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液（约20ml）研磨成浆状，得匀浆液。

b.将匀浆液（除去组织碎片）于3000r/min离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀（内含DNP），沉淀中加两倍体积的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液，搅匀，如前离心，重复洗涤2~3次。所得沉淀为DNP粗制品，移至烧杯中。

2、DNA的纯化：

a.取粗品DNA，加入5μl RNA酶，用玻璃棒慢慢搅拌20分钟。

b.向沉淀中加入冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液，使总体积达到20ml，在缓慢搅拌的同时滴加25%的SDS溶液1.5ml，边加边搅拌，此步骤使核酸与蛋白质分离。

c.加入2mol/L NaCl溶液 5ml，使NaCl最终浓度为1mol/L，搅拌10分钟（速度要慢）。溶液变得黏稠并略带透明。

d.加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，于冰浴中搅拌20分钟，3000r/min离心10分钟。分层，上层为水相（含DNA钠盐），中层为变性的蛋白沉淀，下层为苯酚/氯仿/异戊醇混合液。

e.用吸管小心地吸取上层水相，弃去沉淀，再在相同条件下重复抽提2~3次。

f.取上清液放入干燥小烧杯中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。加乙醇时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动，随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠状物质，并能逐步缠绕与玻璃棒上，此时玻璃棒搅动的目的在于把黏稠丝状物缠在玻璃棒上，直至再无黏稠丝状物出现为止。黏稠丝状物即是DNA。

g.用2ml 80%乙醇洗涤沉淀物1次。

h.室温干燥，直到附于玻璃棒的残余液滴干净。

i.用1~2ml TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。

注意事项

1、选择的实验材料要新鲜，处理时间不宜过长。

2、提取和纯化的DNA不纯，加溶解液大少使浓度过大，或者沉淀物太干燥，这些因素都会导致提取的DNA不易溶解。

3、苯酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取，表明含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。