实验室免疫血清制备方法——江苏菲亚

一、免疫方法

根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。

1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；

2.第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧窝及鼠蹊部皮下。

4.间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5~1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外，也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。

二、放血

(一) 心脏采用血法

1.家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；

2.剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；

3.用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；

4.用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；

5.将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。

(二) 颈动脉放血法

1.家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；

沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；

3.分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；

4.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；

5.用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；

6.松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80~100ml。

三、分离血清

将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3~4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01%硫柳汞或0.02%叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。

原创作者：江苏菲亚生物科技有限公司