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慢病毒转染悬浮细胞效率低

提供者:上海岑特生物科技有限公司   发布时间:2024/6/24 11:30:12  阅读次数:17次   进入该公司店铺

   病毒一直是基因转导研究中的一大利器,尤其 慢病毒 更是实验室的常客。然而,慢病毒的存储不当或用量不合适,可能会导致转染效率低,细胞状态差等情况。
  
  慢病毒感染效率低,主要需要考虑的问题有
  
  1、细胞是否适合用慢病毒进行感染?(慢病毒适用于大部分细胞系,例如肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等,但也有一些细胞不适合用慢病毒感染,可能更适合用腺病毒,可查阅文献,或咨询上海远慕生物)
  
  2、慢病毒是否进行了正确的存储和稀释?(如果病毒存储不当或反复冻融会降低病毒滴度/活性)
  
  3、感染操作问题(MOI是否合适,感染方法,感染及观察时间是否合适)
  
  4、对于一些难感染细胞的感染方法:例如悬浮细胞可使用平角离心转染法,其他一些较难感染的细胞可进行二次感染。
  
  5、可以添加助转染试剂polybrene增加感染效率
  
  慢病毒的安全和存储
  
  慢病毒相关实验需要在生物安全柜(BL-2别)内进行操作,如果不小心溅出也不要惊慌,立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净即可。接触过病毒的枪头,离心管,培养板等要用84消毒液浸泡后统一处理。病毒相关的废弃物也需要特殊收集再统一经高温灭菌处理哦。
  
  慢病毒是存储在-80℃的,如果您在收到慢病毒的一周内就会使用,也可放在4°C保存,避免反复冻融,有必要可以先/进行分装。
  
  摸索病毒感染的MOI
  
  MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)是指每个细胞感染的病毒数,通常MOI越高,病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
  
  用96孔板摸索梯度值:
  
  实验一天,以每毫升3~5X10^6个目的细胞接种96孔培养板中的12个孔,
  
  体积为90 µl。感染预实验共分为四组,每组三个不同梯度的MOI。
  
  实验开始,配备1X10^8TU/ml、1X10^7TU/ml、1X10^6TU/ml病毒液。
  
  将10 µl三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为1X10^6TU,1X10^5 TU,1X10^4 TU,而细胞经过生长,此时细胞的数目大约为1 X10^4个,所以三个孔的MOI分别为100、10、1
  
  感染3-4天后,观察荧光表达情况,通过细胞感染效果,确认目的细胞的感染条件和感染参数。
  
  每孔加病毒量(µl)=MOI*细胞数/滴度(TU/ml)×1000
  
  确定了细胞的MOI值,下面就要开始进行细胞的感染
  
  1/2小体积感染法,即在正常培养液的一半量的情况下加入慢病毒,感染4h后补足培养液至正常体积,感染24h后换液。对于适用Polybrene的细胞,也可适量加入来提升感染效率,它常用的工作浓度为6~8µg/ml。
  
  感染后48h,对于带GFP报告基因的病毒,可通过荧光显微镜观测GFP表达效率,如果要筛选稳定携带Puromycin抗性基因的病毒,则需换上含适当浓度Puromycin的新鲜完/全培养液。
  
  注:不同实验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响,MOI值也略有差异,以下数据是在细胞感染效率在85-100%细胞状态良好的情况下获得的,仅供参考。
  
  对于一些特殊的细胞在感染时还要注意以下事项
  
  ◆悬浮细胞:感染悬浮或半悬浮细胞,要通过平角离心转染法,低速(200´g)离心1 h,然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限,没有平角离心机,可用离心管代替。
  
  ◆难感染的细胞:对于难感染的细胞,如DC(树突状细胞)等,可采用多次感染的方法,即感染24 h后,更换新鲜病毒进行二次感染,可显著提升感染效率。
  
  ◆传代能力较差的原代细胞:对于一些传代能力较差的原代细胞,比如BMSC等,建议采用滴度更高的腺病毒进行感染。

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