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实时荧光定量PCR技术原理与优点

提供者:上海远慕生物科技有限公司   发布时间:2021/11/4 10:08:08  阅读次数:72次   进入该公司店铺

实时荧光定量PCR(Real time PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程,并对起始模板进行定量分析的方法。其涉及域包括:临床疾病诊断、动物检验检疫、食品安全和科学研究等。在xin型guan状病毒、肝炎、艾zi病、流感、登革热、感染性腹泻等的检测、诊断和治疗上发挥着重要作用。

实时荧光定量PCR法可分别为SYBR Green l荧光染料法和Taqman探针法。日常进行核酸检测就是运用Taqman探针法,新guan病毒核酸检测也是利用此项技术。该法高度特异,其核心是利用Taq酶的3’→5’外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。

在Taqman探针法的定量PCR反应体系中,包括一对PCR引物和一条探针。探针的5’端标记有报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等,3’端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q),如TAMRA等。当探针完整时,报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收,仪器不能检测信号。随着PCR反应的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其3’→5’外切核酸酶活性被探针切断,报告基团远离淬灭基团,能量不能被吸收,就产生荧光信号。因此每经过一个循环,荧光信号就和目的片段一样有一个同步指数增长过程。

这里涉及基线和CT值的概念。基线是用来确定背景的荧光信号强度的参比对照,相当于PCR指数扩增期以的荧光强度水平。CT值是PCR扩增过程中,荧光信号开始由本底指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,其由扩增反应体系中模板的初始浓度决定。

与传统PCR相比,实时荧光定量PCR有着以下优点:

1.检测结果既可以定性,也可以定量;

2.检测灵敏度高;
 

3.无需进行凝胶电泳实验,节省实验时间,提高了效率。

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图1 Taqman探针法工作原理

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图2 实时荧光定量PCR的几个主要参数


 

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