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常规聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

提供者:上海古朵生物科技有限公司   发布时间:2021/9/14 11:25:21  阅读次数:20次   进入该公司店铺

  试剂、试剂盒丙烯酰胺单体贮液Tris-甘氨酸缓冲液贮液电缓冲液样品缓冲液过硫醆铵浓缩胶缓冲液贮液分离胶缓冲液贮液

  实验步骤

  一、垂直平板电泳的制胶

  用于垂直平板电泳的凝胶通常被灌注在两侧有隔片的两块玻璃板之间。模具垂直放置,周围用硅油(或其他密封物质)密封,或用夹子夹紧,以免胶液泄漏。溶液从顶部灌注。灌胶完成后从顶部插入梳子,以形成加样孔。梳子宽度取决于玻璃板的宽度,梳子的厚度和凝胶的厚度取决于隔片的厚度。

  在垂直电泳装置上可以进行连续电泳或不连续电泳。它们的差别之一在于制胶方法的不同。连续电泳仅有分离胶,并且整个电泳使用相同缓冲系统,所以灌胶是为方便的。不连续电泳需要先灌注分离胶(均一胶或梯度胶),再灌注浓缩胶,需要掌握一定的技术。垂直电泳用的灌胶模具种类繁多,应根据说明书使用。常用的连续电泳的凝胶配方,贮液配置如下:

  1. 丙烯酰胺单体贮液
  11.1 g 丙烯酰胺 + 0.3 g N,N'-甲叉双丙烯酰胺,先用 35 ml 双蒸水溶解, 搅拌,直到溶液变成透明,再用双蒸水稀释至 50 ml,过滤。用棕色瓶,可在 4℃ 保存一个月。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物,要小心操作。

  2. Tris-甘氨酸缓冲液贮液(pH 8.9)
  30.04 g 甘氨酸 + 1.0 g 叠氮钠,用 1.5 L 双蒸水溶解,用 Tris 滴定至 pH 8.9,再用双蒸水稀释至 2.5 L。

  3. 电缓冲液
  1 份 Tris-甘氨酸缓冲液贮液 + 1 份双蒸水。

  4. 样品缓冲液
  1 ml Tris-甘氨酸缓冲液贮液 + 0.1 mg (或适量)溴酚蓝 + 19 ml 双蒸水。

  5. 10% 过硫醆铵
  0.1 g 过硫酸铵 + 1.0 ml 双蒸水。使用新鲜配制。

  由 Ornstein 和 Davis 先发展的不连续电泳(当时用于圆盘电泳)是将浓缩胶(非排阻性大孔凝胶)加在分离胶上,并且使用不同缓冲系统。所以需要分别灌注分离胶和浓缩胶。不连续电泳的凝胶配方,贮液配置如下:

  1. 丙烯酰按单体贮液
  14.55 g 丙烯酰胺 + 0.45 g N,N'-甲叉双丙烯酰胺,先用 35 ml 双蒸水溶解,搅拌,直到溶液变成透明,再用双蒸水稀释至 50 ml,过滤。用棕色瓶可在 4℃ 保存一个月。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物,要小心操作。

  2. 浓缩胶缓冲液贮液(0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8 )

  3.03 g Tris 溶解在 40 ml 双蒸水中,用 4 mol/L 盐酸调至 pH 6.8。再用双蒸水稀至 50 ml,保存在 4℃ 备用。

  3. 分离胶缓冲液贮液(1.5 mol/L Tris-HCl,pH 8.9 )
  18.16 g Tris 溶解在 80 ml 双蒸水中,用 4 mol/L 盐酸调至 pH 8.9。再用双蒸水稀至 100 ml,保存在 4℃ 备用。

  4. 10% 过硫酸铵
  0.1 g 过硫酸铵 + 1.0 ml 双蒸水。使用新鲜配制。

  5. 电缓冲液
  0.025 mol/L Tris,0.2 mol/L 甘氨酸,pH 8.3。
  15.14 g Tris + 72.07 g 甘氨酸,用双蒸水稀释到 5 L。可在室温保存一个月。

  6. 样品缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl,pH 6.8 )
  2 ml 浓缩胶缓冲液贮液 + 1 ml 87% 甘油+ 0.1 mg 溴酚蓝,用双蒸水稀释至 10 ml,可在 -20℃ 保存 6 个月。

  按配方在模具中灌注分离胶后, 小心地在分离胶的表面加一层水(或水饱和的异丙醇或正丁醇),封住胶面,以促使聚合并使凝胶表面平直。 凝胶在 30~40℃ 放置约 40 分钟~1 小时后,可以看到一个界面,表示凝胶聚合。吸掉水(或水饱和的异丙醇或正丁醇),用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶,然后灌注浓缩胶。并插入与模具大小相同,与凝胶厚度相当的梳子。为防止气泡陷入,梳子应倾斜插入。然后让模具再静止放置在 30~40℃,聚合约 40 分钟~1 小时。如果带着梳子过夜可能会影响分辨率,所以浓缩胶好在使用再灌注。

  如灌注线性梯度胶,则在灌注分离胶时需要用梯度混合器,有时还需要蠕动泵。梯度混合器分贮液腔(盛轻液)和混合腔(盛重液)。两腔间有腔间阀。后者与出口相连接。混合液从混合腔中流出。改变两个腔的大小或溶液配方,就能改变梯度的斜率。在贮液腔中插入凸形锥体(convex ) 或凹形锥体(convave) 就能形成指数梯度(指数梯度不常用)。梯度混合器的使用方法参见“水平平板电泳的制胶”。

  二、水平平板电泳的制胶

  水平电泳与垂直电泳的制胶方法在连续电泳时相同,不连续电泳时的制胶方式都为垂直灌注,差别只在于:

  1. 垂直电泳用的凝胶在顶端用梳子形成加样孔,而水平电泳可在凝胶聚合后在胶面上加样或在凝胶上做加样孔。

  2. 垂直电泳必须先灌注分离胶,后灌注浓缩胶,以便插入梳子;水平电泳用的凝胶是平铺在冷却板上电泳的,所以可以先灌注浓缩胶,后灌注分离胶。且浓缩胶中加有甘油,所以不需等待聚合,便可接着灌注分离胶,使操作大为简便。而且由于浓缩胶中的甘油使加样孔中保有一定的水,所以对样品的高盐浓度不敏感,有时可以免去透析。

  3. 垂直电泳是先灌注分离胶,所以底部的梯度胶浓度大;而水平电泳是后灌注分离胶,所以顶部的凝胶浓度大。这样在聚合时不会有热对流的干扰。 并且这种灌注法不会在小孔径凝胶中有高浓度的甘油,可以避免在电泳时由于甘油吸湿而引起小孔的泡胀。

  4. 垂直电泳制胶后,不需取胶,仍将胶置于玻璃板中电泳;但水平电泳需要将聚合后的凝胶从灌胶模具中取出,平铺于冷却板上进行电泳,因此电泳时冷却效果较好。

  5. 目水平电泳用的凝胶厚度大多薄于垂直电泳。薄胶从分辨率,电泳时间, 灵敏度,保存方便,实验材料的节省等方面都显然优于厚胶,是当发展的方向。

  如果要在凝胶上做加样孔,需要准备一块可重复使用的小孔成型模板。模板通常是用不附着胶的玻璃板制作的。先用去污剂清洗玻璃板,然后用蒸馏水淋洗。用滤纸吸干,再用无水乙醇淋洗玻璃表面以去掉任何残留的不纯物。把玻璃板放在坐标纸上,贴几层隔片带在玻璃表面上,见图 4.9。用一把锐利的刀去掉多余的隔片带。在小孔成型条之间切成 2~3 mm 的小段。所加层的数目和条的宽度取决于样品体积。小孔成型条的长条取决于计划的加样数。例如,加 5 ml 样品,小孔成型条应该是两层厚,2 mm 宽和 7 mm 长。小孔成型条制成的孔可加多至 100 μl 的样品。

  隔片带可以用 DYMO 带(一种不干胶带)制作小孔成型条。如果凝胶厚为 1 mm,应在玻璃模板上贴两层。如果凝胶厚为 0.5 mm,应贴一层。为了保持电流通过小孔,凝胶层应覆盖在小孔底部小厚度 0.2 mm。

  小孔应做在浓缩胶和分离胶界面的浓缩胶一侧,使小孔和阴之间为均一的浓缩胶。

  组装模具先将玻璃板洗净,在不黏胶的玻璃板上涂一层不黏胶的硅烷。把黏胶的支持膜铺在另一块玻璃板上,用滚筒赶去气泡和多余的水,用夹子夹好模具。为防止凝胶在灌注时聚合,应预先将模具放在 4℃ 冰箱中预冷。灌注线性梯度胶的贮液同不连续电泳,配方见表 4.7。先将一定量的轻液注入梯度混合器的贮液腔,小心打开腔间阀,赶去腔间气泡,如有轻液流入混合 腔,需吸回贮液腔,关上腔间阀。再将重液注入混合腔,并加入搅拌子。梯度混合器应置于已调水平的磁力搅拌器的合适位置上,两腔中的液面应该相平。每腔先各加入 TEMED,再加过硫酸铵。先打开腔间阀,再立即打开流出管的夹子, 两腔中的液面应同时下降。梯度混合器与模具之间应有合适的高度差,使灌注在 1~5 分钟完成。灌注后在室温静止 15 分种,再放在 30~40℃ 烘箱中聚合。聚合约需 1 小时完成。聚合后在 4℃ 至少放置 12 小时使其充分聚合,孔径均匀后才可使用。梯度胶的灌注比较繁杂,但它可以分离复杂样品。由于分子筛的作用,有较好的分辨率,且谱带细窄。

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