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乙酰辅酶A测试盒

提供者:上海雅吉生物科技有限公司   发布时间:2021/2/23  阅读次数:192次   进入该公司店铺我要询价

 乙酰辅酶 A(Acetyl-CoA)含量测定试剂盒说明书
 微量法 100 管/96 样
正式测定务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
乙酰辅酶 A 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中
产生的种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是个枢纽性的物质。糖、脂肪、
蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶 A 汇聚成条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸
化,经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水,释放能量用于 ATP 合成。此外,乙酰辅酶
A 是合成脂肪酸,酮体,胆固醇及其衍生物等生理活性物质的体物质。
测定原理
苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和 NAD 生成草酰乙酸和 NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶 A
和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶 A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应,乙酰辅酶 A
含量和 NADH 的生成速率成正比,340nm 下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶 A 含量的高
低。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 支,-20℃保存。临用加入 250μL 试剂五充分溶解备用;用不完的试剂 4
℃保存周;
试剂三:液体×1 支,4℃保存。临用加入 250μL 试剂五充分溶解备用;用不完的试剂 4℃
保存周;
试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用加入 22.5mL 试剂五充分溶解备用;用不完的试剂 4
℃保存周;
试剂五:液体 30mL×1 瓶,4℃保存。
工作液的配制:临用请根据拟用工作液体积(样本数×0.23 m L),将试剂二、三和四
按照 1:1:90 的比例混合,或者直接把试剂二和试剂三加入到试剂四中混匀(可以测定 96 样);
加样置 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴锅中预热 30 min;现配现用;
乙酰辅酶 A 的提取
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量
(104个):试剂体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试
剂),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):试剂体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,
加入 1mL 试剂),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min,用蒸馏水于 340nm 处调零。
2、 将工作液置 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴锅中预热 10 min。
2、取 25μL 样本和 230μL 工作液至微量石英比色皿或者 96 孔板,混匀,立即记录 340nm
处 20s 的吸光值 A1 和 80s 时的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
乙酰辅酶 A 含量计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为 y = 1640x + 0.012;x 为吸光值,y 为标准品浓度(nmol/mL)。
注意:本试剂盒低检测限为 1.6nmol/mL。
(1)按照蛋白浓度计算
乙酰辅酶 A含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA+0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA+0.012) ÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
(2)按照样本质量计算
乙酰辅酶 A 含量(nmol/g 鲜重)=[(1640×ΔA+0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA+0.012)
÷W
(3 ) 按照细菌或细胞密度计算:
乙酰辅酶 A 含量(nmol/104
)=[(1640×ΔA+0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA+0.012)÷500
V1:加入反应体系中样本体积,0.025mL;V2:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质
浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为 y = 3280x + 0.024;x 为吸光值,y 为标准品浓度(nmol/mL)。
注意:本试剂盒低检测限为 1.6nmol/mL。
(1)按照蛋白浓度计算
乙酰辅酶 A含量(nmol/mg prot)=[(3280×ΔA+0.024) ×V1]÷(V1×Cpr)=(3280×ΔA+0.024) ÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
(2)按照样本质量计算
乙酰辅酶 A 含量(nmol/g 鲜重)=[(3280×ΔA+0.024) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(3280×ΔA+0.024)
÷W
(3 ) 按照细菌或细胞密度计算:
乙酰辅酶 A 含量(nmol/104)=[(3280×ΔA+0.024)×V1]÷(500×V1÷V2)=(3280×ΔA+0.024)÷500
V1:加入反应体系中样本体积,0.025mL;V2:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质
浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

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