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为什么细胞养不好?你可能忽略了这些细节

提供者:上海古朵生物科技有限公司   发布时间:2020/6/22  阅读次数:58次   进入该公司展台

细胞培养时中常遇到的那些不可忽视的问题,及我们该如何解决呢?

一、细胞的营养来源

针对大多数肿瘤细胞,营养配方一般为:90%合成培养基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS);为了防止污染,可以加1%双抗!

常见问题解答:

Q:针对不同细胞,细胞培养基配方一样吗?如何获知呢?

A:不同细胞的培养基是不同的。一般ATCC购买的细胞,针对不同细胞株,会有详细介绍,包括生长的状态图、培养基的类型等。如人源乳腺癌细胞MCF-7细胞一般为1640,人源肺癌细胞A549可用DMEM培养基。

Q:培养基为什么一般都是偏红色?

A:因为培养基加了酚红来显示颜色,指示pH范围为6-8,颜色会由黄变为紫红。这是为了我们能更直观观察培养液的变化,如变黄,则代表偏酸,偏碱性了就显示偏紫色。一般来说,细胞吸收营养后,变黄后就暗示我们要换培养基啦!所以密切观察很重要哦!

Q:大多数细胞系可以在不止一种培养基中生长,那可以替换吗?

A:不建议更换ATCC指定的培养基,因为当培养基改变时,细胞的性质可能也会变化。

Q:若是细胞生长缓慢,是否可以增加血清比例?

A:可以!

二、细胞的居住环境

舒适无菌的环境是细胞健康生活的重要基础。如下图为培养细胞的器皿,包括形状、规格、用途多样的培养瓶、培养皿及培养板。最终住进37℃,5%CO2的恒温培养箱。

常见问题解答:

Q:细胞培养板规格不一,如何正确选用?

A:根据不同规格的细胞培养皿/板容量及用途,如流式一般用 6 孔,爬片一般用 24 孔,MTT 一般用 96 孔,等。

Q:细胞培养皿和培养瓶区别?

A:就细胞培养状态来说,培养瓶和培养皿没有太大区别,主要在于安全系数(培养瓶>培养皿)、培养细胞数量(大培养瓶>培养皿)。但是培养瓶成本也会相对较高,因此无特殊要求,一般选择培养皿即可。

三、细胞的复苏与冻存(原则是慢冻速融)

1. 细胞复苏:指将冻存的细胞解冻之后重新培养,细胞恢复生长的过程。

常见问题解答:

Q:为什么细胞复苏后,很多难以贴壁?

A:忽略培养基的问题,主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快,可不时摇动冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。

Q:为什么细胞贴壁了,却长不起来?

A:此时需要考虑的是细胞密度问题,一些细胞倾向于维持一定的密度,若复苏的细胞生长缓慢,可将细胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。                                          

2. 细胞冻存 将细胞放在低温环境(-70℃~-196℃),细胞内的代谢降低,可最大限度的保存细胞活力,以便长期储存。

常见问题解答:

Q:目前细胞冻存液多采用的什么配方?

A:目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂,细胞冻存液的配方有很多种,如培养基:血清:DMSO=7:2:1或8:1:1或5:4:1,或直接用血清:DMSO=9:1,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,复苏存活率在80%~90%以上。

Q:若没有细胞冻存盒,我们该怎么办?

A:可先将冻存管放入4℃冰箱中10min,再移至-20℃冰箱30min,-80℃冰箱2h或过夜,最后放入液氮罐内。为了节约时间,还可直接在冻存盒外包裹一团棉花,用棉花代替冻存盒缓慢降温的特点,将细胞转移至-80℃冰箱过夜,再转移至液氮保存。

Q:细胞冻存时对细胞量有要求吗?

A:细胞复苏时会有一定的细胞死亡,因此细胞的浓度应足够高,起始浓度106—107个/ml/管;

四、细胞的传代培养

细胞传代:细胞在培养过程中不断增殖,培养皿/瓶空间有限,当细胞接触过密,生长就会受到抑制,影响细胞状态,因此我们要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶里。

常见问题解答:

Q:为什么我们总说选择对数期细胞传代?

A:细胞的生长和分裂,一般遵循以下模式:停滞期,对数期(指数期),平稳期(平台期)和衰退期。为了确保活力,遗传稳定性和表型稳定,必须使细胞保持在对数期。

Q:那如何确定细胞对数期?

A:根据上述细胞生长曲线,为了确保活力,必须使细胞保持在对数期就传代,所以一定不能等到细胞长满100%融合时才去消化传代。一般细胞长到 70% -80%左右即可传代。

Q:一般细胞传代都是1分2吗?

A:要根据不同细胞而定,如有的生长很快,比如说4T1细胞,传代取离心悬液的十分之一就已经足够了。有的又特别慢,比如 BT474。此时我们就要多观察摸索最合适的传代比例。

Q:消化很关键吗?

A:不得不说,细胞状态差,很多时候与传代时胰酶消化密切相关。一般肿瘤细胞消化1-2min即可。但是每一种细胞贴壁能力不同,因此对胰酶的反应也不同,我们需要密切跟踪。一般肉眼观察到贴壁细胞层能移动即可终止;而非细胞全部分散成单个。

Q:部分比较难消化的细胞怎么办?

A:可放于37℃培养箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受细胞为例,放于37℃培养箱消化5-8min,轻轻拍打,才见细胞成片移动,因此针对难消化细胞一定要在显微镜下密切观察。

Q:几天换培养基?

A:正常情况下,培养液偏红色。如果细胞维持在pH6.5~6.6条件下,培养基变黄,说明培养液中代谢产物已堆积到一定量,细胞会脱落死亡,需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1~2天换一次,生长缓慢时,3~4天亦可。针对复苏后的细胞,建议隔天换液。

Q:每天观察细胞有必要吗?

A:一般的肿瘤细胞我们是隔天传代,但是切不可忽略对细胞的观察,一定要每天都要去看一下细胞,肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。记住,是每天。

Q:如果细胞形态不清晰或有异物等,如何处理?

A:可以考虑如下操作:首先,倒掉旧的培养基,用新的培养基或者PBS洗涤2-3次,再开始正式的消化、吹打。其次,把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。

Q:细胞污染怎么办?

A:如发现细胞有污染,一般应立即丢弃。如果细胞非常宝贵,可试着加入含抗生素的培养基反复清洗,并用抗生素含量高的培养基培养,并经常更换培养基.

关键词:细胞  远慕生物  

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