在无数实战经验中，制备高质量的单细胞悬液被公认为重中之重。实验过程中，如单细胞活性不高，细胞数过低，以及污染和杂质等问题，都会影响到有效单细胞数的产出、单细胞核酸的质量等，最终得到的单细胞数据分析及统计结果不可信。

那么，组织如何解离？需要选什么酶？还需要注意什么？远慕生物根据相关权威文献整理了单细胞悬液制备的方法和小贴士，让我们一起来解决单细胞研究方案中的拦路虎。

实体组织解离关键——酶的合理选择

实体组织解离两大步骤，包含机械分离和酶消化处理。

首先，组织需要通过物理切割或刀片切碎，然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间不同，相关建议可参考如下表格：人和小鼠的部分组织类型——肝脏、肺、皮肤、脾脏、消化道、胰腺、肾脏、视网膜等。

表1 人鼠各类型组织酶解单细胞悬液方法总结[1]

除此之外，常用酶的类型还包括：Accutase™、弹性蛋白酶和胶原酶，以及商业酶混合物，如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等。

血液处理成关键——离心稳定操作[1]

样品经过密度离心（例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技术），可以直接用于外周血单核细胞（PBMC）捕获[1]。

建议不少于5mL EDTA 抗凝血，且不要使用肝素抗凝管收集血液；同时注意在合适转数离心操作后，管中内容物分为三层，上层为血浆（内含细胞碎片），中间层为分层液，底层为红细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单核细胞层（ 白膜层，薄）。此时，需使用无菌吸管小心沿离心管壁周缘吸取界面层单核细胞后，再加入HBSS /PBS重悬。更多注意事项请参见华大科技单细胞送样建议。

单细胞悬液制备的8条建议[1]

1. 建议采用无菌样品处理方式，包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。

2. 为降低对细胞的损伤，移液和离心应保持在最低程度。在一定的离心速度、时间和温度下，细胞浓度和大小直接影响制备的效率。

3. 在进行细胞清洗和重悬过程中，使用具有合适大小的器皿，避免高浓度导致细胞集聚和结块，请注意选择。

4. 应使用适当大小的细胞过滤器过滤悬浮液，孔径大于细胞直径，以去除团块和碎片。

5. 细胞清洗和复苏，推荐使用含牛血清的磷酸盐缓冲盐水（不含钙和镁），减少细胞损失和聚集的白蛋白。

6. 细胞裂解升高可导致细胞团块形成，在细胞分离过程中，DNase I可减少细胞团块形成。

7. 细胞团块会导致自动细胞计数器低估单个细胞的有效浓度，因此制备后应尽快处理悬浮液，最好在30分钟内处理。

8. 总之，在单细胞制备中，尽可能减少细胞聚集物、死亡细胞、非细胞核酸和逆转录（RT）抑制剂是非常重要的。为了在最大限度地提高不同细胞类型的纯度和无偏回收率的同时，最小化这些污染物，可能需要应用优化，例如，调整洗涤步骤的数量、洗涤溶液的组成、离心条件和/或过滤器类型。

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