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磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)

提供者:上海彩佑实业有限公司   发布时间:2019/9/11 8:52:08  阅读次数:369次   进入该公司店铺

 
实验方法原理
磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
 

 
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
实验步骤
一、悬浮细胞的染色

将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次,加入100 ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20 ug/ml)10 ul,室温避光30 min,再加入PI(50 ug/ml)5 ul,避光反应5 min后,加入400 ul Binding Buffer,立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1 h), 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
 
二、贴壁培养的细胞染色

先用0.25%的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

三、 爬片细胞染色

同上,*后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
 
四、结果 
 

收起 
注意事项
1.  整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。
 
2.  操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。

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