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分析硝基呋喃代谢物的实验方法

提供者:上海斯迈欧分析仪器有限公司   发布时间:2019/8/1  阅读次数:68次   进入该公司展台

 硝基呋喃类抗生素药物及其代谢物具有制畸胎副作用,且能诱发癌症,引起了人们的高度关注。欧盟、美国、中国等诸多国家和地区先后禁止在动物源性食品中使用,检测限为不得检出。硝基呋喃原药对光敏感,在动物体内迅速被代谢,故检测在食品中的代谢物。

 

化学试剂

硝基呋喃(nitrofuran)化合物名称、分子式和CA号:

呋喃它酮 3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinon,其代谢物为AMOZC8H15N3O3CAS: 43056-63-9

呋喃唑酮 3-Amino-2-oxazolidi ,其代谢物为AOZC3H6N2O2CAS: 80-65-9

呋喃西林 Semicarbazide,其代谢物为 SEMCH5N3OCAS: 57-56-7

呋喃妥因 1-Amino-hydantoin ,其代谢物为AHDC3H5N3O2CAS: 2827-56-7

硝基呋喃化合物及代谢物的结构:

 

A:将药物代谢物从组织中提取出来;B:药物代谢物与2-硝基苯jia醛(2-NBAC7H5NO3CAS: 552-89-6)的衍生化反应。建议的内标:D4-AOZD5-AMOZ13C15N2-SEM13C3-AHD

 

色谱分离流动相的制备

1 M乙酸铵溶液:77 g乙酸铵溶解于1 L HPLC级的水中。

流动相A:在1 L HPLC级的水中,加入1 mL 1 M 乙酸铵溶液。

流动相B:在1 L HPLC级的甲醇中,加入1 mL 1 M 乙酸铵溶液。

 

样品制备(肉、虾样品)

基于 Leitner 等人提出的方法[1]

1. 称取1g匀浆的组织样品;

2.加入内标;

3.加入0.125M盐酸和2-硝基苯jia(2-NBA)

4.调节pH值为7.4

5.离心;

6.用乙酸乙酯在 Extrelut 柱上提取上清液;

7.挥干溶剂;

8.用500µL流动相[+1mM乙酸铵/甲醇=90/10]

回收率[2]AOZ 70%AMOZ 80%SEM 70%AHD 70%

 

样品制备(肝脏组织)

基于Conneely等人提出的方法[3]

1.称量5g浸水并匀浆过的肝脏组织,衍生化过夜;

2.将样品溶液pH值调成中性,用乙酸乙酯提取,挥干溶剂;

3.将残渣溶于6mL水中,上样到准备好的MAX柱上;

4.先用2%氨水溶液3mL清洗,然后用3mL甲醇进行洗脱,挥干溶剂;

5.将残渣溶于3mL水中,上样到准备好的HLB柱上;

6.先用2%乙酸溶液(溶剂:水+甲醇=1/1) 3mL清洗;

7.然后用3mL溶于90%甲醇中的2%的氨水溶液进行洗脱。

 

样品制备(蜂蜜样品)

基于Blake等人提出的方法[1]

1.加50µL内标溶液到5g蜂蜜中;

2.热水中超声5min,使混合均匀;

3.加入20mL 0.3M盐酸(混合300mL 1M HCl700mL的水制成),振摇使均匀;

4.加入1mL衍生化试剂(1g 2-NBA溶解于50mL二甲亚砜DMSO中制成,用前新鲜配制)

5.涡流混旋1min,使混合均匀,37℃保温16h进行衍生化;

6.加入2mL 1M磷酸缓冲液(磷酸缓冲液pH=7.4),加入1M NaOH(7.38.2mL)到溶液pH=7±0.5,注

意:pH值不可以超过7.5

7.加入15mL HPLC级的乙酸乙酯,涡旋混合5min

8.在3000r/min离心10min,直至有机相与水相明显分层,如果没有很好分层,继续离心;

9.仔细转移上面乙酸乙酯层溶液5mL,到一干净的16mm×100mm的玻璃试管中,注意不要将下面水层溶液带入;

10.蒸发到只剩1mL左右;

11.再仔细转移出3mL上层乙酸乙酯溶液,到相同玻璃试管中;

12.蒸发到只剩1/2时,涡旋混合,再蒸发至干;

13.加入200µL甲醇进行溶解,再加入200µL水,混合均匀。然后取出200µL到样品瓶中,备用。

 

色谱分离条件

Agilent 1100 系统:G1312A二元泵系统、G1367A型自动进样器、柱温箱。

色谱柱:Phenomenex LUNA3µmC18(2)150mm×2mm

流动相:A相—水+1mM 乙酸铵;B相—甲醇+1mM 乙酸铵。

 

MS/MS检测

API 3000™ LC-MS/MS液质联用仪系统TurboIonSpray® 离子源,正离子模式,MRM扫描方式。

关键词:液质联用仪  

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