主要用途

真菌/酵母细胞β1，3- D-葡聚糖合成酶活性定量检测试剂是一种旨在通过β1，3- D-葡聚糖合成酶反应系统中尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖底物聚合成葡聚糖，与荧光染料结合产生荧光峰值的变化，来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种真菌或酵母细胞株裂解悬液中β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，具有高通量特点。

技术背景

真菌/酵母细胞壁结构具有丰富的糖蛋白外层和碳水化合物内层，包括（1,3）-β-D，（1,6）-β-D和（1,3）-α-D-葡聚糖（glucan）。其中（1,3）-β-D为主要元素。1,3-β-D-葡聚糖合成酶（1,3-β-D-glucan synthase；GS；EC.2.4.1.34），又称为尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖：1,3-β-葡萄糖基转移酶（UDP-glucose：1,3-β-glucosyl transferase），催化以尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）为底物，通过1,3-β链接聚合为葡聚糖的反应，构成真菌/酵母细胞壁结构中主要碳水化合物成分1,3-β-D-葡聚糖，为细胞生长所必需。1,3-β-D-葡聚糖合成酶具有两种结构体：1个调节亚体，GTPase Rho1p和4个催化亚体，Bgs1p－4p或Fksp。（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶成为抗真菌药物，例如卡泊芬净（caspofungi）等的靶标。基于底物UDP-glucose在葡聚糖合成酶的催化下，聚合成（1,3）-β-D－葡聚糖产物，与苯胺蓝（Aniline blue；4,4-（carbonyl-bis（benzene-4,1- diyl）-bis-（imino）-bis-benzenesulfonic acid）反应产生复合物，呈现荧光峰值的变化（激发波长400nm，散发波长460nm），由此定量测定β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性。

产品内容

裂解液（Reagent A） 毫升

强化液（Reagent B） 毫升

缓冲液（Reagent C） 毫升

底物液（Reagent D） 微升

终止液（Reagent E） 微升

反应液（Reagent F） 毫升

稀释液（Reagent G） 微升

标准液（Reagent H） 微升

产品说明书 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent F）避免光照；终止液（Reagent E）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

1

用户自备

15毫升锥形离心管：用于真菌/酵母细胞收集的容器

1.5毫升离心管：用于真菌/酵母细胞裂解操作或反应液配制的容器

台式离心机：用于沉淀真菌/酵母细胞

微型台式离心机：用于真菌/酵母细胞裂解悬液澄清

超速离心机：用于微粒体样品制备

恒温培养箱或恒温水槽：用于反应孵育

比色皿或酶标板：用于染色后荧光检测的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

一、 样品准备

1． 准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107细胞/毫升）

2． 移入到预冷的15毫升锥形离心管

3． 置于冰槽里5分钟

4． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀

7． 转移到预冷的1.5毫升离心管

8． 加入xx微升强化液（Reagent B）（注意：参见注意事项3）

9． 强力涡旋震荡15秒

10．置于冰槽里1分钟

11．重复实验步骤9至10五次

12．加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀

13．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3500RPM，例如eppendorf 5415）

14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15．（选择步骤）如果使用微粒体样品，放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g

16．（选择步骤）小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

17．移取5微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

18．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪（温度为25℃）：激发波长400nm，散发波长460nm，并置零

3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4． 分别加入xx微升稀释液（Reagent G）到2至5号管

5． 移取xx微升标准液（Reagent H）到1号管，混匀

6． 小心移取xx微升1号管稀释的标准液（Reagent H）到2号管，混匀

7． 小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent H）到3号管，混匀 2

8． 小心移取20微升3号管稀释的标准液（Reagent H）到4号管，混匀

9． 将1至5号管置于室温下备用；标准管浓度见下表

管号

稀释液（Reagent G）

标准液（Reagent H）

标准葡聚糖浓度

1

――

微升

纳摩尔/升

2

微升

微升1号管

纳摩尔/升

3

微升

微升2号管

纳摩尔/升

4

微升

微升3号管

纳摩尔/升

5

微升

0

0

三、 标准曲线测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管

2． 加入5微升上述配制的标准液

3． 加入xx微升终止液（Reagent E）

4． 放进80℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30分钟，避免干枯

5． 加入xx微升反应液（Reagent F），混匀

6． 放进50℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30分钟，避免光照

7． 室温下孵育30分钟，避免光照

8． 转移到比色皿或酶标板

9． 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光读数

10．重复实验步骤1至9四次

11．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准葡聚糖浓度（纳摩尔/升）

四、 样品测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管

2． 加入xx微升底物液（Reagent D）

3． 加入xx微升上述制备的待测样品（20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白），混匀（注意：样品须清澈）

4． 室温下（25℃）孵育30分钟

5． 加入xx微升终止液（Reagent E）

6． 放进80℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30分钟，避免干枯

7． 加入xx微升反应液（Reagent F），混匀

8． 放进50℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30分钟，避免光照

9． 室温下孵育30分钟，避免光照

10．转移到比色皿或酶标板

11．即刻放进荧光分光光度仪检测：获得样品相对荧光读数

12．根据标准曲线获得样品对应葡聚糖浓度

五、 计算样品活性

[根据标准曲线获得样品对应葡聚糖浓度（纳摩尔/升）X样品稀释倍数]÷ X xx（分钟）＝皮摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝皮摩尔/毫克/分钟 3

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括标准样

2． 操作时，须戴手套

3． 强化液（Reagent B）为固体状，移取方法为：使用1毫升枪头，将尖端部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的盖子内圈盛满；或秤重0.1克

4． 终止液（Reagent E）具有腐蚀性，注意操作安全

5． 建议测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需；建议使用－Bradford蛋白质浓度定量检测试剂盒（30030.1）

6． 荧光测定后，比色皿须清洗彻底

7． 酶活性单位浓度定义：在28℃室温下，pH 7.8的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）合成1微摩尔的葡聚糖

8． 待测样本为微粒体，其蛋白浓度为20微克/5微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为100至200微克/5微升（本公司提供 GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）

9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

10．本公司提供系列真菌/酵母细胞酶学相关试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感