【阿仪网 行业资讯】中国科学院深圳先进技术研究院医工所生物光学与分子影像研究室郑炜研究员团队在高分辨双光子显微成像技术研发方面取得重要进展。

显微成像系统，是指显微镜下观察样品拍照成像的系统。通过调节物镜成像的位置（成像介于目镜的一倍焦距与两倍焦距之间），使物镜所成的像位于目镜前焦点的外侧，经目镜放大得到一个经二次放大的正立实像，当光源足够强时，相机或摄像机的光电元件感光成像。显微成像系统是显微镜与摄像技术相结合的产物，可对人眼无法看到的微生物进行观察拍照。在显微镜上加接专用连接镜头，接上CCD摄录镜头，再把动态的图像传送到计算机，获得动态图像，从而观察生物不同生长阶段的发育形态。可对昆虫细胞和病菌孢子高倍放大进行观察，并可远程进行图像采集储存处理。

深圳先进技术研究院成功地将多帧重构算法用于双光子成像，采用自主研发的自适应光学模块和相位补偿方法，实现了双光子成像轴向分辨率3倍提升，信噪比提升也超过3倍;又开发了新型自适应光学方法用于提高双光子成像质量。该方法使1mm左右的深层脑组织成像时，成像分辨率提升1倍，信噪比提升5倍。

荧光成像的理论基础是荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定的范围内与荧光素的量成线性关系。荧光成像系统包括荧光信号激发系统（激发光源、光路传输组件）、荧光信号收集组件、信号检测以及放大系统（CCD、PMT）;荧光信号收集系统主要包括振镜式的扫描系统和摆头式扫描系统。振镜式的扫描系统通过快速摆动反射镜将反射光信号捕获，而摆头式扫描系统通过平移探头来实现等距信号的捕获。

双光子显微镜带有的超高灵敏度的直接探测器能记录组织深层最细微的内部结构。多达7个的外置通道以及光谱拆分软件充分支持多色的多光子实验。再结合高速12kHz扫描头和最大扫描视野，将轴向位移减至最小，有效地收集来自深层组织的微弱光子，使图像更明亮，将对标本的光毒性减至最小。双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其频率可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

配备固定载物台的双光子显微镜能提供最佳的机械稳定性，将电噪声干扰减至最低，可以说是专为活体标本及电生理而设。而可远程操控的2孔切换物镜转盘能实现无振动切换避免给复杂高稳定要求的实验带来干扰。物镜带防腐蚀陶瓷表面，以及延展至红外范围的色差校正，是同时进行多光子成像以及电生理数据记录的理想工具。

一些配备前置补偿的飞秒级激光器和OPO激光器的双光子显微镜，所有红外激光器的操控，包括前置补偿单元的微调等，都能由徕卡软件完成。有了OPO激光器之后，红色和绿色荧光都能同时被激发了，从而达到更好更清晰的记录效果。