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线粒体复合体Ⅲ试剂盒微量法@新产品

2021/11/25 10:48:25提供者: 赫澎(上海)生物科技有限公司 进入该公司展台
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货号:YX-W-C302                                                 规格:100/96

线粒体复合体试剂盒说明书

微量法

正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

线粒体复合体EC  1.10.2.2) 又称 CoQ-细胞色素C还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C,生成还原型细胞色素C

测定原理:

与氧化型细胞色素C不同,还原型细胞色素C550nm有特征光吸收,因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体酶活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 1.5mL×1 支,-20℃保存;

试剂四:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;

试剂六:液体 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;

样本的处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g4℃离心5min

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g4℃离心10min

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体(此步可选做)。

5、步骤中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10,重复30次),用于复合体酶活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

1)工作液的配制:将试剂五转移到试剂四中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其

它物种)孵育5min;用不完的试剂4℃可保存一周;

2)在微量石英比色皿或96孔板中依次加入10μL样本、200μL工作液和25μL试剂六,立即混匀,记录550nm处初始吸光值A12min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1

复合体活力单位的计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T

=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W×V÷V样总)÷T=124×ΔA÷W

3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.248×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2.35×10 -4 Lε:细胞色素C摩尔消光系数,1.91×10 4 L/mol /cmd:比色皿光径,1cmV 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500 万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下:

1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T

=1230×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(W ×V ÷V 样总)÷T=248×ΔA÷W

3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.496×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2.35×10 -4 Lε:细胞色素 C 摩尔消光系数,1.91×10 4 L/ mol /cmd96 孔板光径,0.5cmV 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,0.202mLT:反应时间,2 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500 万。

微信号:ayiwangapp17

标签:线粒体复合体Ⅲ试剂盒  

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