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HEPENGBIO 植物 V 型氢 ATP 酶(H +-ATPase)活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒 产品说明书(中文版)

2019/8/9提供者: 赫澎(上海)生物科技有限公司 人气指数:67 进入该公司展台

 HEPENGBIO 植物 V 型氢 ATP 酶(H
+-ATPase)活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒
产品说明书(中文版)
主要用途
HEPENGBIO 植物 V 型氢 ATP 酶(H
+-ATPase)活性酶连续反应光度法定量检测试剂是一种旨在使用 V
型氢 ATP 酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,在特异性抑制剂存在与否的情况下,受到 V
型氢 ATP 酶的水解产生的 ADP 过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应,即
采用光度法测定其氧化后吸光峰值(NADH 浓度)的变化,以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术
方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织,包括种子(seed)、叶片(leaf)、
根(root)、胚胎叶(cotyledon)、上胚轴(epicotyl)等 V 型 H
-ATP 酶的特异性活性检测。产品不含污染
性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。 技术背景
氢 ATP 酶(H
-ATPase;EC3.6.3.6),又称为质子或氢离子转位 ATP 酶(Proton-Translocating ATPases),在
生物能量传导过程中起着重要作用。其分成三类:质膜型(plasma membrane type 或 P 型)、真细菌型
(eubacterial type 或 F 型)和囊/液泡型(vacuolar type 或 V 型)。质膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊
泡的质膜上,约 100kd 蛋白;真细菌型存在于叶绿体、线粒体和细菌上,由疏水的膜部分和亲水的催化部
分组成;囊/液泡型存在于真核生物细胞器的囊泡系统。其中植物质膜氢 ATP 酶,100kd 分子量,是植物细
胞膜上重要的功能酶,为植物生命活动的主要酶之一。氢 ATP 酶催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机
磷。这一去磷酸化反应释放出能量,成为细胞生命代谢的能源。同时利用细胞内 ATP 释放的能量逆向跨质
膜把质子转运出细胞,产生并保持细胞膜或细胞器两侧氢离子的电化学梯度,为一系列次级转运体和通道
蛋白对各种营养物质及离子的跨质膜转运提供能量。植物氢 ATP 酶还参与细胞内 pH 水平、细胞伸长、气
孔开闭、以及植物对环境的应激反应等多种生理过程的调节。基于底物 ATP,在 V 型氢 ATP 酶敏感性抑制
剂巴佛洛霉素 A1(bafilomycin A1)存在与否的情况下,受到 V 型氢 ATP 酶的水解,进而通过丙酮酸激酶
(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二
核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其峰值的变化(340nm),来定量分析 V 型氢 ATP 酶的活性。
其反应系统为: 产品内容
HEPENGBIO 清理液(Reagent A) 毫升
HEPENGBIO 裂解液(Reagent B) 毫升
HEPENGBIO 缓冲液(Reagent C) 毫升
HEPENGBIO 酶促液(Reagent D) 毫升
HEPENGBIO 反应液(Reagent E) 毫升
HEPENGBIO 底物液(Reagent F) 毫升
2
HEPENGBIO 阴性液(Reagent G) 毫升
HEPENGBIO 专性液(Reagent H) 微升
产品说明书 1 份
保存方式
保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;HEPENGBIO 底物液(Reagent F),避免光照,有效保证 6 月
用户自备
15 毫升锥形离心管:用于样品制备的容器
1.5 毫升离心管:用于样品制备和保存的容器
DOUNCE 匀浆器:用于组织匀化
微型台式离心机:用于样品制备
培养箱:用于反应孵育
比色皿:用于光度分析的容器
分光光度仪:用于光度分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;HEPENGBIO 底物液(Reagent F)
注意避光;HEPENGBIO 缓冲液(Reagent C)室温下预热。然后进行下列操作。
一、 样品准备(总蛋白制备)
1. 准备好新鲜的植物组织(叶片、谷粒、种子等),并秤重以确定组织重量
2. (选择步骤)放进预冷的 15 毫升锥形离心管
3. (选择步骤)加入适量的(1 克组织需要 3 毫升)HEPENGBIO 清理液(Reagent A)清洗 1 次
4. 即刻用刀片切碎组织
5. 放进一个预冷的 15 毫升锥形离心管
6. 加入预冷的 xx 毫升 HEPENGBIO 裂解液(Reagent B)
7. 涡旋震荡 5 秒,充分混匀
8. 即刻放进预冷的 DOUNCE 匀浆器,在冰槽里用匀浆棒匀化组织(约 80 下)
9. 将所有组织匀浆物移入 1.5 毫升离心管,放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟,速度为 5000g(或
7500RPM,例如 eppendorf 5415)
10.小心移出上清液(注意:不要触碰沉淀物)到另一个新的预冷的 15 毫升锥形离心管
11.(选择步骤)如果上清液含有肉眼可见的残渣,重复离心 5 分钟一次,速度为 5000g(或 7500RPM,
例如 eppendorf 5415)
12.即刻移入到 1.5 毫升离心管
13.移取 10 微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 HEPENGBIO Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒-
HEPENGBIO30030.1)
14.放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、测定准备
3
1. 准备好待测样品(例如植物组织细胞裂解样品等),置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪(温度为 28℃):波长为 340nm,间隔 5 分钟,读数 7 次(共 30 分钟),并置零
三、 背景对照测定
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 酶促液(Reagent D)
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反应液(Reagent E)
4. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液(Reagent F)
5. 放进 28℃培养箱里静置 3 分钟
6. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 阴性液(Reagent G)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 10 分钟或 30 分钟
四、 样品总活性测定
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 酶促液(Reagent D)
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反应液(Reagent E)
4. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液(Reagent F)
5. 放进 28℃培养箱里静置 3 分钟
6. 加入 50 微升待测样品(注意:100 微克总蛋白)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 10 分钟或 30 分钟
五、 样品非特异活性测定
实验开始前,移取 50 微升待测样品(注意:100 微克总蛋白)到 1.5 毫升离心管,加入 xx 微升 HEPENGBIO
专性液(Reagent H)(注意:使用前需融化),混匀后,放进 28℃培养箱里孵育 15 分钟。然后置于冰槽里
备用
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 酶促液(Reagent D)
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反应液(Reagent E)
4. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液(Reagent F)
5. 放进 28℃培养箱里孵育 3 分钟
6. 加入 60 微升上述预处理的待测样品
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 10 分钟或 30 分
五、 计算样品活性
4
1)样品活性(总活性和非特异活性)
2)样品特异活性
注意事项
1. 本产品为 20 次操作,包括背景对照测定
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需 1 次
4. 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA 等,可以使用 SUCROSE、IMIDAZOLE
5. 建 议 使 用 质 膜 样 品 为 佳 ( HEPENGBIO 植 物 组 织 质 膜 ( plasma membrane ) 分 离 试 剂 盒 —
HEPENGBIO16022)
6. 加入样品启动反应后 3 秒内即刻光度测定
7. 反应测定值由高到低变化;测定可以持续 30 分钟
8. 测定值由高到低变化,即 0 分钟测定读数高于 10 分钟或 30 分钟测定读数,表明有酶活性
9. 光度测定后,比色皿须清洗彻底
10.建议待测样本总蛋白浓度为 100 微克/50 微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;
注意计算公式的调整(本公司提供 HEPENGBIO Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 HEPENGBIO30030.1)
11.V 型氢 ATP 酶活性单位浓度定义:在 28℃温度下,pH 7.5 条件下,每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位
12.本公司提供系列 ATP 酶类分析技术产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测准确

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