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黄嘌呤氧化酶(xanthione oxidase, XOD)试剂盒说明书 微量法
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黄嘌呤氧化酶(xanthione oxidase, XOD)试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
XOD(EC 1.17.3.2)催化黄嘌呤氧化生成尿酸和超氧阴离子,是活性氧主要来源之一;同时也是核苷酸代谢的关键酶之一。XOD主要分布于哺乳动物的心,肺,肝脏等组织中,当肝功能受损时,XOD大量释放到血清中,对肝损害的诊断具有特异性的意义。
测定原理:
XOD催化黄嘌呤产生尿酸,尿酸在290nm下有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、
研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:30mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×2 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
操作步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至290nm,蒸馏水调零。
2、XOD 检测工作液的配制:用时在每瓶试剂二中加入15mL试剂一,充分混匀,待用;用不完的试剂 4℃可保存一周;
3、测定前将XOD检测工作液在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和250μL工作液,立即混匀并计时,记录290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算 ΔA=A2-A1。
XOD 活性计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)XOD 计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化产生1nmol尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=2131×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 XOD 计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T
=2131×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T
=2131×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每一万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=4.26×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.6×10-4 L;ε:尿酸摩尔消光系数,1.22×104 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)XOD 计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化产生1nmol尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=4262×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 XOD 计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T
=4262×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T
=4262×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每一万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=8.52×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.6×10-4 L;ε:尿酸摩尔消光系数,1.22×104 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:
反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万。
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