ELISA实验步骤一览表

间接法（测抗体）

双抗体夹心法（测抗原）

竞争法（测抗原）

抑制性测定法

1

包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度（5～20μg/ml）各0.3ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2～3小时,贮存冰箱

包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱

包被特异性抗体：

同左

包被抗原：

同左

2

洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟

同左

同左

同左

3

加被检标本：每凹孔加入用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0.2ml，37℃，作用1～2小时

每凹孔加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。

分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2ml，另一组只加酶标记抗原液0.2ml，37℃作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度）。

a组加参考抗体和被检抗原混合液0.2ml，另一组加参考抗体与等量稀释剂0.2ml，37℃作用1～2小时。

4

洗涤：重复2

同左

洗涤：同左

洗涤

5

加入酶结合物：每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2ml。37℃作用1～2小时

加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。

——

各加入0.2ml抗参考抗体的酶结合物37℃作用1～2小时。

6

洗涤：重复2

同左

——

洗涤

7

加入0.2ml底物溶液于每个凹孔,(O.P.D或O.T)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4ml底物加0.1ml终止剂）。

同左

同左

同左

8

加终止剂：每凹孔加2M H₂SO₄或2M柠檬酸0.05ml。

同左

同左

同左

9

观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（O.P.D用492nm）O.D值。

同左

用酶标比色计测定a、b两组O.D值，并求出a、b、O.D值的差数。

同左