间接法ELISA和夹心ELISA

间接法 ELISA
溶液准备：
包被液：包被液50mM Na2CO3 （ pH9.6 ）, 20mMTris-HCl （ pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ）
封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等
洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 （ pH7.4 ）
实验程序：
将抗原按适当浓度溶解于包被液中。
在对应的孔中加入100μl抗原，室温孵育2h或4℃过夜。
倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。
每个孔中加300μl封闭液，孵育1h。
倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。
每个孔中加100μl一抗，37℃孵育1h或室温孵育3h。
倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。
每个孔中加100μl二抗，室温孵育1h。
倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。
用洗涤液浸泡5min，拍干残留液体，这次的洗涤步骤对于减少背景信号是很重要的。
每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复5次。
每个孔中加100μl底物，显色30min并立即在405-410nm读数。
夹心ELISA
溶液准备：
包被液：50mM Na2CO3 （ pH9.6 ）, 20mMTris-HCl （ pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ）
封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等
洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 （ pH7.4 ）
AKP偶联的链球菌亲和素溶液：用1×封闭液稀释酶偶联物
实验程序：
将捕获抗体包被液稀释至相应的浓度。
在对应的孔中加入100μl抗体溶解液，室温孵育2h或4℃过夜。
倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。
每个孔中加300μl封闭液，孵育1h。
倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗脱液清洗两次。
每个孔中加100μl生物素标记的检测抗体，37℃孵育1h或室温孵育3h。
倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。
每个孔中加100μl AKP偶联的链球菌亲和素，室温孵育1h。
倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗脱液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。
用洗涤液浸泡5min，拍干残留液体，这一步对于减少背景信号是很重要的。
每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复5次。
每个孔中加100μl底物，显色30min并立即在405-410nm读数。

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