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小鼠心脏组织2-DE蛋白样品的制备步骤
点击次数：439 发布时间：2013/7/17 8:33:49
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刘**
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小鼠心脏组织2-DE蛋白样品的制备有六个步骤
1. 心脏组织2-DE蛋白样品的制备
1） 将冷冻的小鼠心脏组织在液氮条件下研磨成粉末；
2） 然后加入5 x体积蛋白裂解液（7 M Urea, 2 M Thiourea, 40 mM Tris, 4 % CHAPS, 65mMDTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 mM protease inhibitor cocktail, 0.5% Pharmaltes, pH3-10），用Teflon匀浆器匀浆组织1 min，超声匀浆30s；
3） 室温放置10 min，4oC；
4） 14,000 g离心30 min，收集上清，-80oC储存备用。蛋白质裂解液保存在-20oC冰箱里备用。
2. 蛋白质含量测定
按Amersham 2-D Quant Kit操作说明进行:
1） 取3ul蛋白样品进行定量，每管样品加入500ul沉淀剂（precipitant），漩涡振荡，室温下放置2-3 min；
2） 加入500 ul共沉淀剂（co-precipitant），混匀；
3） 4℃，10,000 g离心5 min；
4） 弃上清，尽量没有可见液体残余，加入100ul铜溶液（copper solution），和400ul去离子水，漩涡振荡使蛋白沉淀溶解；
5） 加入1 ml显色工作液（working color reagent, color reagent A :color reagent B=100:1），快速混匀，室温下放置15^＇20 min; 490 nm处测定吸收峰；
6） 所得结果根据标准曲线计算样品蛋白含量。
原创作者：南京森贝伽生物科技有限公司
