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技术文章

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)

点击次数:173 发布时间:2019/7/15 9:01:02

 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)测定试剂盒

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate  carboxylase,  PEPCase)是 C4 植物和CAM 植物固定CO2的关键酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸,在植物和细菌中广泛存在,在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。此酶是变构酶,主要功能为三羧酸循环提供草酰乙酸, 另外也与 C4 植物光合二氧化碳固定反应及景天科植物的苹果酸形成 (景天酸代谢 )等有关。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)检测试剂盒检测原理如下:在弱碱条件下,PEPCase 催化 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO2形成草酰乙酸(OAA);OAA 在苹果酸脱氢酶(MDH)催化下被 NADH 还原为苹果酸 (Mal) 。在碱性条件下每吸收 1 分子 CO2伴随 1 分子 NADH 氧化,通过分光光度计测定处吸光度的变化,计算出 NADH 的消耗速率,进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。

该试剂盒主要用于检测植物样本中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。

按照一次使用1 ml 提取缓冲液计算,试剂盒可以使用100次。

 自备材料:

植物材料;剪刀;液氮;研钵或其他研磨设备;1ml石英比色皿;紫外分光光度计;制冰机;低温离心机

 操作步骤:

一、 即用型PEPCase提取缓冲液配制:

 

一个反应配制体积

n个反应配制体积

 

1 ml

n×1 ml

PEPCase提取缓冲液(

500 μl

n×500μl

灭菌水

470 μl

n×470 μl

1 M DTT100×

10 μl

n×10 μl

BSA溶液50mg/ml

20 μl

n×20μl

注:1. 即用型PEPCase提取缓冲液尽量现配现用,短期4中可以过夜保存。

 PEPCase样品提取:

1. 取新鲜植物组织,清洗干净,擦干,液氮中研磨,1 cm2叶片(1分硬币大小)或0.1g叶片粉末加入1 ml 即用型PEPCase提取缓冲液,颠倒混匀,冰浴放置5-10分钟。

2.12000g4℃离心 5分钟,上清即为PEPCase提取液,冰浴放置备用。

注:提取液立即测定,不建议保存。

PEPCase活性测定分析

1. 即用型酶溶解缓冲液配制:

       按照标签所示,在试剂6-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液(50mg/ml),混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液,冰浴备用,-20℃保存。

2. 试剂3-PEP:按照标签所示加入灭菌水,彻底混匀后冰浴备用。

3. 试剂4-NADH:按照标签所示加入灭菌水,彻底混匀后冰浴备用。

注:NADH稳定性较差,用后-20℃贮存3-4天,长期-80℃保存。

4. 试剂5-MDH:按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液,彻底混匀后冰浴备用。

5. 反应体系设定:

加入顺序

组份

1ml反应体系加入量

(测定1个样品)

MasterMix配制

(测定n个样品为例)

1

10×PEPCase Assay Buffer

100 μl

n×100 μl

2

灭菌水

 870 μl

n×870 μl

3

NADH溶液(100×

10 μl

n×10μl

4

PEP溶液(100×

10 μl

n×10 μl

5

MDH溶液(100×

10 μl

n×10 μl

5. 反应体系测定;

1.5 ml离心管中配制以下反应

 

1

2

 

对照反应

样品活性测定

MasterMix

975 μl

975 μl

即用型PEPCase提取缓冲液(步骤一)

25 μl

-

PEPCase样品提取液

(步骤二)

-

25μl

 

 

混匀后加入到1 ml比色皿中,立即计时,此时吸光度为A0,每隔 10s 测定一次吸光度,其中至 1min 时处吸光度记为A1,记录其变化。

注意: = 1 \* GB3  一般分光光度计OD340读数在0.5-3之间数据比较准确,低于此范围说明提取用的材料太少,酶活性太低;高于此范围说明所用材料太多,酶活性太高,此时可以将PEPCase样品提取液用即用型PEPCase提取缓冲液稀释后测定。

= 2 \* GB3  该反应系统是利用速率变化,求得相应 OD 的变化,进而推算出 NADH 的消耗速率,再进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。 因此加入PEPCase样品提取液后立即计时很重要,每次检测指标不宜过多,否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。

PEPCase活性计算:

根据如下公式计算样品中PEPCase活性:

1. 根据叶片面积的计算公式:

Activity(μmol·m-2·S-1)==

Activity(μmol·m-2·S-1)-表示每秒每平方米叶片有多少μmol NADH被氧化

△A-反应*初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值,△A=A0-A1

N-稀释倍数,本程序中为40(1 ml提取液,取25μl测定)。

6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数

d-cm 比色皿光程,一般为1  △t-秒 测定时间,本程序为60秒  S-cm2 提取时使用的叶面积

2. 根据叶片鲜重的计算公式:

Activity(μmol·g-1·S-1)==

Activity(μmol·g-1·S-1)-表示每秒每克鲜重叶片有多少μmol NADH被氧化

△A-反应*初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值,△A=A0-A1

N-稀释倍数,本程序中为40(1 ml提取液,取25μl测定)。

6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数

d-cm 比色皿光程,一般为1

△t-秒 测定时间,本程序为60秒

g- 提取时使用的叶片鲜重

原创作者:上海科研试剂供应商

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