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疯牛病构象依赖性免疫测定方法(CDl)
点击次数：1120 发布时间：2012/10/17 9:26:20
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崔**
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本方法是由美国InPro公司开发研制，是一种双抗体夹心免疫测定方法，2003年通过欧盟认证。其原理是利用抗体能识别暴露在未变性处理的正常PrPc表面的构象性表位，但不能识别未变性的PrPSc，且这种构象性表位在变性的条件下也暴露在致病性PrPSc和正常的PrPc表面，然后利用时间分辨荧光技术，检测PrP抗体对正常PrPc和异常PrPSc表面构象性表位的亲和力的差异，从而得出检测结果。本方法的最低检出量为1 ng／m1。
本试验和其他试验不同之处在于它不需要蛋白酶K处理PrPc和PrPSc，从而提高了能够检测的朊病体蛋白含量。最近报道此试验正用来对牛进行活体检测。本方法的反应时间约为3．5h，特异性和敏感性均为100％。
疯牛病构象依赖性免疫测定方法的主要步骤如下。
（1）样品准备 取脑闩部组织，匀浆处理。
（2）抽提 匀浆液用低浓度的PK酶溶液处理，以便通过低速离心分离掉细胞杂蛋白成分。
（3）浓缩 用磷钨酸盐（PTA）将上清的PrPSc选择性地沉淀下来，高速离心收集沉淀。
（4）变性 一半沉淀样品不变性处理，在这份样品中PrPSc的抗体结合位点被隐藏，而样品中的PrPc的结合位点则暴露。其余一半沉淀样品在高温下变性，所有蛋白质解除高级结构而成一级结构，因而PrPc和PrPSc均暴露出抗体结合位点。
（5）捕获 将处理好的样品加入包被有捕获抗体的ELISA板中，然后洗掉未结合的样品。
（6）标记 将铕标检测抗体加入ELISA板中，该抗体会与PrP结合，然后洗去未结合的检测抗体。
（7）释放 加入增强剂以释放铕，稳定铕以便检测。
（8）检测 铕的特定性放射使得检测信号从背景信号中分辨出来。N代表PrPc的检测结果，D代表PrPc+PrPSc的检测结果。比较N值和D值便可知道样品中是否含有PrPSc。
原创作者：上海金穗生物科技有限公司
