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细胞冻存方法、步骤及注意事项

点击次数:10646 发布时间:2015/2/12 10:14:48

细胞越来越受广大科研者的喜爱,但细胞不像人们想象中那么强大,在培养复苏等过程中稍有不慎就不可能导致它的死亡。而且它必须是是在无污染的条件下培养,复苏才能保证实验效果。在此恒远公司技术为您详细总结细胞的正确冷冻保存方法、保存详细步骤,相关注意事项如下:
 
一、保存方法(主要有两个):
(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3
℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

二、步骤:
(1)冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO加入新鲜培养基中,*后浓度为5~10%,混合均匀,置于室温下待用。
(3)依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。

三、注意事项:
(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80–90%致密度。细胞冻存前应保证细胞的活力好,无污染
(2)冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(3)3.一定要保证DMSO的浓度是10%,冻细胞要舍得用进口的DMSO
(4)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10ml小体积分装,4
℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。
(5)慢冻,快解冻。细胞在 -15 度左右胞内形成结晶对细胞损伤,缓慢降温有助于减少损伤,故放入 -20 度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便,保存时间过久会影响细胞活力。

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