实验原理

本试剂盒采用双抗体夹心两步法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗检测蛋白抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入牛检测蛋白校准品和待测样本，再加入生物素标记抗体，经过温育与充分洗涤后，再加入HRP偶联的亲和素，经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-生物素标记抗体-亲和素酶的夹心复合物。加底物A和B，产生蓝色产物，在终止液作用下，终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中检测蛋白的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中检测蛋白的浓度。

试剂盒组分与保存

组分	数量	主要成分	开封后储存
校准品	0.35ml/管	－－	2-8℃14天
包被微孔板	96T/48T	预包被固相抗体	2-8℃14天
生物素抗体	10mL	生物素抗体	2-8℃180天
HRP标记亲和素	10mL	HRP标记亲和素	2-8℃14天
样本稀释液	6mL	PBS	2-8℃180天
底物液A	6mL	0.01%过氧化氢	2-8℃180天
底物液B	6mL	0.1%TMB	2-8℃180天
终止液	6mL	2mol/L酸	2-8℃180天
20×浓缩洗涤液	25mL	0.05%Tween20	2-8℃180天
说明书	1份	－－	－－
自封袋	1个	－－	－－
不干胶	4片	－－	－－

 

注意：

1：使用请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致。

2：如果试剂盒的组份需要再次使用，请确保上一次使用之后没有被污染。

3：酶标板单次未使用完，要谨记密封放到2-8℃保存。

试验所需自备试验器材 (不提供，但可协助购买)

1.标准规格酶标仪。

2.自动洗板机。

3.振荡器。

4.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，好用多通道移液器。

5.用去离子水将 25×TBS-T 洗涤缓冲液稀释 25 倍，成 1×TBS-T 洗涤缓冲液。

 

样品的准备和保存

以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

细胞培养上清——离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

血清——用干净试管收集血液，室温凝固 30 分钟，离心 2000×g 20 分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

血浆——采用肝素、柠檬酸盐或 EDTA 抗凝，抽血后 30 分钟内在 2-8℃离心 2000×g 20 分钟。为消除血小板的影响，建议在 2-8℃进一步离心 10000×g 10 分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

细胞裂解液——对于贴壁细胞，去除培养液，用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常 10 后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000—14000×g 离心 3-5 分钟， 取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

尿液——用无菌管收集，离心 2000×g 20 分钟。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

操作程序

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。

1、按面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

3、设置标准品孔、样本稀释液孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本稀释液孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。除空白孔外，每孔加入生物素抗体100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育60min。

4、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

5、除空白孔外，每孔加入HRP标记亲和素100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育20min。

6、重复步骤4。

7、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育15min。

8、所有孔加入终止液50μL，在450nm波长酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。

结果计算

9、以标准品浓度做为横坐标，对应的吸光度（OD值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。【用ELISA Calc软件计算】

10、如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的终浓度。

经典数据

（1）标准曲线：
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。每次检测，每块酶标板都必须设立标准曲线。

（2）精密度：

批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。

批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。

 

 

（3）灵敏度：

低检出剂量小于15.63 pg/mL(6 次独立实验的平均值)。

10 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两倍 SD，计算低可检测浓度。

（4）回收率：

分别往不同样本中添加已知的高、中、低浓度目的蛋白样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在85%-115%之间。

样本类型	回收率范围（%）	平均回收率（%）
血清(n=5)	89-102	95
血浆(EDTA)(n=5)	89-106	98
细胞培养基(n=5)	86-101	95

（5）稀释线性：

将添加有高浓度牛白介素8(IL-8)ELISA试剂盒的样本分别稀释 2 倍，4 倍，8 倍，16 倍做回收实验，得出回收率范围及平均回收率。

		血清	血浆(EDTA)(n=5)	细胞培养基(n=5)
1:2	回收率范围(%)	95-113	94-111	93-110
	平均回收率(%)	96	98	96
1:4	回收率范围(%)	82-115	85-112	86-112
	平均回收率(%)	97	97	98
1:8	回收率范围(%)	86-111	86-113	94-108
	平均回收率(%)	102	96	103
1:16	回收率范围(%)	91-113	84-108	94-105
	平均回收率(%)	98	98	99