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NAD激酶（NADK）活性检测试剂盒（微量法）
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NAD激酶（NADK）活性检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA1229
产品规格：100管/48样
产品简介：
NADK（EC 2.7.1.23）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是目前所发现的生物体内惟一能够催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶，可催化NAD(H)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及调节NAD(H)与NADP(H)的平衡上具有重要作用。
NADK催化NAD+磷酸化，生成NADP+；NADP+可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH；NADPH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT），通过其在570nm的吸光值大小可反映出NADK活性的大小。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂一 | 液体5mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂二 | 液体10mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂四 | 粉剂×1支 | -20℃ |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂六 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂七 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃ |
试剂八 | 液体14μL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂九 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂十 | 液体40mL×1瓶（自备） | 2-8℃ |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃ |
溶液的配制：
1.试剂三：用时加入3mL双蒸水，充分溶解，可分装保存，-20℃保存两周，禁止反复冻融；临用前取出一支稀释100倍使用。
2.试剂四：用时加入1mL双蒸水，充分溶解，4℃保存；
3.试剂五：用时每瓶加入2mL双蒸水，充分溶解，4℃保存；
4.试剂六：用时加入2mL双蒸水，充分溶解，4℃保存；
5.试剂七：用时加入2mL双蒸水，充分溶解，4℃避光保存；
6.试剂八：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入0.986mL蒸馏水充分溶解，可分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
7.试剂十：自备95%乙醇；
8.标准品：加入1.9mL蒸馏水，即得2μmol/mL NADP标品。临用前稀释100倍得20nmol/mL NADP标准溶液备用。
需自备的仪器和用品：
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、无水乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）：
1.细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.血清（浆）样品：直接检测。
二、测定步骤：
1.可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至570nm，95%乙醇调零。
2.标准品的配制：按下表混合试剂三和标准品配制标准品
标准品（μL） | 试剂三（μL） | 标准管浓度（nmol/mL） |
0 | 50 | 0 |
5 | 45 | 2 |
10 | 40 | 4 |
15 | 35 | 6 |
20 | 30 | 8 |
25 | 25 | 10 |
30 | 20 | 12 |
35 | 15 | 14 |
3.操作表：（在EP管中操作）
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 10 | 10 | - | - |
标准品 | - | - | 10 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 10 |
试剂一 | 14 | 24 | 24 | 24 |
试剂三 | 10 | - | - | - |
试剂四 | 6 | 6 | 6 | 6 |
充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴15min，立即煮沸2min（盖紧，防止水分散失）。之后10000rpm常温离心5min，取20μL上清于1.5mL EP管中，继续加入下列试剂。 | ||||
试剂二 | 50 | 50 | 50 | 50 |
试剂五 | 15 | 15 | 15 | 15 |
试剂六 | 15 | 15 | 15 | 15 |
试剂七 | 15 | 15 | 15 | 15 |
试剂八 | 7 | 7 | 7 | 7 |
室温避光静置20min | ||||
试剂九 | 100 | 100 | 100 | 500 |
混匀静置5min，20000g，常温离心5min。去上清，留沉淀。 | ||||
试剂十 | 200 | 200 | 200 | 200 |
充分溶解沉淀后，放于微量比色皿或96孔板中在570nm下测定吸光值，分别记为A测定，A对照，A标准，A空白，计算ΔA测定=A测定- A对照，ΔA标准=A标准-A空白。
三、NADK活性计算：
1.标准曲线的绘制：
以NADP标准品浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。将ΔA
测定带入公式得到x（nmol/mL）。
2.NADK活力的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK（U/mg prot）=x×V样本÷（Cpr×V样本）÷T= 0.067×x÷Cpr。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK（U/g鲜重）= x×V样本÷（W×V样本÷V提取）÷T = 0.067×x÷W。
（3）按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK（U/104cell）=x×V样本÷（500×V样本÷V提取）÷T = x×1.33×10-4
（4）按血清（浆）体积计算：
单位的定义：每mL血清（浆）在反应体系中每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK（U/mL）=x÷T=0.067×x
V样本：加入样本体积：0.01mL；；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V提取：加入的提取液 体积，1mL；500：细菌或细胞总数，500万；T：反应时间，15min。
注意事项：
1.样本的处理必须在0℃-4℃中操作完成，以防止酶变性失活。建议在正式实验前，选取差别较大的两个样本进 行预实验。。
2.试剂三、四、五、六、七、八在测定过程中都必须在冰上放置。
3.当初始吸光值大于0.4时，建议将样品用PBS稀释后测量。
4.若测量样品数量过多，可以将试剂二、五、六、七按比例配成工作液使用。
原创作者：上海尚宝生物科技有限公司
