通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒

商品名称：无

汉语拼音：Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Kuaisu Jiance Shijihe

英文名称：Real-time PCR for Rapid Detection of African Swine Fever Virus

【作用与用途】本试剂盒适用于猪血液、猪肉组织、淋巴结、脾脏等样本中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

1 用法

1.1 样品处理及模板准备

1.1.1 样品处理

·组织样品处理：分别从猪肉组织、淋巴结、脾脏不同位置取样，用手术剪剪碎混匀后取0.1g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml无菌离心管，12000 r/min离心2分钟，取上清200μl备用。

·血液样品无需处理，取200μl备用。

1.1.2 模板准备

·根据不同的样本类型，按照下表准备相应的样本用量。

·将样本加入到1.5 ml离心管中，加入下表体积的Solution A，涡旋震荡20 s，并按照下表的处理方法，室温静置3-5 min，或95℃金属浴振荡孵育3-5 min。  

·样本充分裂解后（95℃金属浴振荡孵育的样本需恢复室温），加入下表体积的Solution B，并涡旋震荡30 s，12000rpm离心2min，上清即为模板DNA。

·处理后的样本如在2小时内进行下一步试验，请于4℃保存，如不能立即进行下一步试验，请于-20℃保存。

备注：组织样本加入10倍体积的生理盐水制成组织匀浆液后，可按照血液样本的处理方法进行处理。

1.1.3可利用商品化试剂盒提取核酸进行反应，效果更佳

1.2 荧光PCR扩增

1.2.1 试剂准备

实验20分钟将试剂从冰箱取出并恢复至室温，使其融化，充分混匀后瞬时离心去除管壁吸附液体。

1.2.2 配制反应体系

按下表1体系，在配套PCR管中配制反应体系，盖紧管盖后瞬时离心10，转移至扩增区。

表1  PCR反应体系

1.2.3 PCR扩增

快速模式

PCR扩增参数

2 判定

2.1 合理调整阈值线，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。

2.2 试剂盒有效性判定

·阴性对照：无Ct值，线形为直线或微斜，无明显指数增长。

·阳性对照：Ct值≤30，有明显指数增长，呈典型的S型曲线。

2.3 样本结果判定

·样本检测结果Ct值≤38，有明显指数增长，判定为阳性，表明样本中检测出非洲猪瘟病毒。

·样本检测结果38＜Ct≤40，判定为可疑。应对样本进行复测，若复测结果Ct值仍在38~40之间，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。

·样本检测结果无Ct值，判定为阴性，表明样本中未检测出非洲猪瘟病毒。

（1）实验请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按步骤执行，不使用本试剂盒提供的组份或不按照说明书进行实验可能导致错误结果。

（2）所有试剂应在规定温度储存。-20℃保存的试剂在使用应充分混匀。试剂盒反复冻融次数不宜超过5次。

（3）实验操作应按照国家有关临床基因扩增实验室管理规范执行，实验过程应分区（试剂准备区、样本制备区、核酸扩增区），各区物品为用，不得交叉使用，避免污染。

等仪器用品应经常用1%次氯酸钠、75%乙醇或紫外灯进行消毒。耗材应进行无酶处理。

（5）待检样本、试剂盒组份及实验中的废弃物需按照具有潜在传染性物质处理方法进行处理。

（6）为防止荧光干扰，应避免使用含荧光物质的手套，避免用手直接接触，预防交叉污染。

（7）检测结果为阴性，并不代表为非感染状态，具体诊断需结合兽医临床。

（8）产生假阴性的可能原因为：待检样本在采集、运输、保存及核酸提取过程中操作不当造成DNA降解；样本中核酸浓度低于检测限；病毒待测靶基因出现变异；未经验证的其他干扰因素。

（9）产生假阳性的可能原因为：待检样本采集、运输及核酸提取过程中发生交叉污染。

【规格】 50反应/盒