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你知道高效液相色谱检测氨基酸的方法吗

点击次数:1040 发布时间:2020/5/27 14:46:27
 

你知道高效液相色谱检测氨基酸的方法吗

 Wayeal 皖仪科技应用开发中心 1周前
 

 




氨 基 酸


    
是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物,羧酸碳原子上的氢原子被氨基取代后形成的化合物。氨基酸分子中含有氨基和羧基两种官能团。与羟基酸类似,氨基酸可按照氨基连在碳链上的不同位置而分为α-,β-,γ-...w-氨基酸,但经蛋白质水解后得到的氨基酸都是α-氨基酸,而且仅有二十几种,他们是构成蛋白质的基本单位。

氨基酸的检测方法较多:分光光度法、气相色谱法、液相色谱法(包括氨基酸分析仪)、毛细管电泳法、化学发光法、荧光光谱法等。


今天我们介绍的是分析实验室较常用的方法
高效液相色谱法

 

柱前衍生法的一种

紫外-可见光检测器检测

17种氨基酸

 

一、前处理(衍生)

 

1.1 标准品的衍生
衍生剂稀释为原浓度1/5:分别移取2ml 的衍生试剂AB于两支10mL 的棕色容量瓶中,用稀释剂分别将其稀释至刻度;精密量取上述对照品溶液0.5mL,置于试管中,加入稀释后的A溶液和稀释后的B溶液各0.25mL,摇匀。室温下反应60min,取出后加入正己烷0.5mL,振摇;放置 30 分钟后取澄清的下层溶液进样分析。

 

1.2 样品的处理与衍生
(此处以饲料样品为例)
称取一定量的饲料样品,称样量根据氨基酸的含量确定(将氨基酸总量控制在10~25mg),置于水解管中。向水解管中精确加入酸水解液10mL,摇匀后放入冰箱冷冻。取出冷冻的水解管,向其中通入氮气并迅速封盖。将水解管置于110 摄氏度恒温箱中水解24 小时。水解完毕后取出水解液冷却至室温,将水解液倒入100mL 容量瓶中,用适量的纯水清洗水解管合并至容量瓶中,纯水定容至刻度。


0.5mL 的水解样品于试管中,用氮气吹干后再用 0.1mol/L 盐酸溶液0.5mL溶解,如有必要可重复此过程一次。
吸取 0.5mL 上述水解液,用1.1的方法衍生

 

二、色谱条件

 

色谱柱:氨基酸专用分析柱

流动相:

流动相 A0.1mol/L 乙酸钠溶液(pH6.5):乙腈=93:7

流动相 B→水-乙腈=20-80
梯度表如下:

 

  长:254nm
进样量:2μl
  温:40℃
  量:1.0mL/min

 

三、标准品谱图

 

1-门冬氨酸、2-谷氨酸、3-丝氨酸、4-甘氨酸、5-组氨酸、6-精氨酸、7-苏氨酸、 8-丙氨酸、9-脯氨酸、10-氯化铵 11-酪氨酸、12-缬氨酸、13-蛋氨酸、14-胱氨酸、15-异亮氨酸、16-亮氨酸、17-苯丙氨酸、18-赖氨酸


 

图2:氨基酸混合标准品-放置较长时间

 

四、样品谱图

 

某饲料

盐酸赖氨酸盐

 

注意

 

 酸水解的过程中,色氨酸被完全破坏;丝氨酸和苏氨酸被部分破坏;蛋氨酸可能会被氧化;半胱氨酸全部转化为胱氨酸,但是胱氨酸的的回收率通常非常小。

 氨基酸的链接顺序对水解也有很大的影响,由于脂肪性氨基酸的疏水端阻碍水解,因此脂肪性氨基酸之间的肽键较难断开,如异亮氨酸-异亮氨酸,缬氨酸-缬氨酸,异亮氨酸-缬氨酸等肽键在110℃加热24 小时,只能断开50%70%

 如果样品存在挥发性盐类和洗涤剂,都会使结果受到影响,尤其对门冬氨酸、谷氨酸、

组氨酸和赖氨酸的影响。

 在水解液氮吹的过程中,如果使用的是普通的氮吹仪,要防止水解液喷溅到金属导气针上,否则含有盐酸的水解液会将导气针上的亚铁离子带入到试管中,污染水解液。被污染的水解液吹干后用水溶解呈现淡淡的黄绿色,且加入衍生试剂后会形成棕褐色絮状悬浮物。


氨基酸检测

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原创作者:济南扬文商贸有限公司

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