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技术文章
植物组织DNA损伤彗星荧光检测试剂盒产品说明书
点击次数:156 发布时间:2024/1/18 14:21:34
主要用途
植物组织DNA损伤彗星(Comet)荧光检测试剂是一种旨在采用分离的细胞核碱性凝胶电泳,在电场环境下,损伤变性的DNA片段迁移形成特定的形态,即DNA移动尾巴,来进行体外评价和半定量分析DNA损伤程度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于新鲜植物组织包括叶片(leaf)、谷粒(grain)、种子(seed)和根尖(root tip)等DNA损伤研究,包括DNA链断裂、氧化性碱基损伤、DNA剪切损伤、DNA交联、DNA修复等,应用于环境和药物毒理学原位监测、原位突变(mutagenesis in situ)分析、氧化应急反应等研究。产品严格无菌,即到即用,性能稳定,操作简便,重复一致。
技术背景
彗星检测技术(Comet assay),又称为单细胞凝胶电泳检测技术(single cell gel electrophoresis assay;SCGE)或微凝胶电泳检测技术(microgel electrophoresis assay),是基于变性切离的DNA片段,在电场的影响下,从细胞中移出的原理,而完整的超螺旋DNA仍然保持在细胞核内。通过凝胶电泳,呈现出分子迁移图形,形成彗星拖尾(comet tail)现象,即完整DNA的细胞染色体为“头”,而松散和断裂的DNA为“尾”,以此评价DNA损伤程度。这是分析单一细胞DNA链断裂的敏感方法。其技术方法的基本步骤是:一,细胞固定包埋在凝胶里;第二,细胞裂解处理;第三,DNA变性处理;第四,电泳迁移;第五,染色和图像分析。由此观察DNA迁移形态,进行体外检测,成为细胞DNA损伤研究的基本手段。
保存方式
保存在4℃冰箱里;染色液(Reagent G)避免光照;有效证6月
用户自备
无离子水:用于稀释电泳缓冲液
电泳液(Reagent E):用于电泳的缓冲液(配方见注意事项8)
中和液(Reagent F):用于电泳后凝胶清洗(配方见注意事项9)
磨砂载玻片和盖玻片:用于放置样品进行微凝胶电泳的器材
恒温培养箱:用于孵育反应电泳槽:用于微凝胶电泳的装置
1.5毫升离心管:用于混匀基质液的容器
90 mm培养皿:用于样品处理、染色等的容器
荧光显微镜:用于观察细胞核彗星现象
实验步骤
一、 琼脂载玻片准备
1. 准备1张全磨砂载玻片,磨砂面朝上
2. 将胶体液(Reagent A)置于微波炉里加热溶化(注意:避免溢出)
3. 放进45℃恒温水槽孵育5分钟
4. 移出xx微升胶体液(Reagent A)到载玻片中间
5. 盖上洁净的盖玻片
6. 轻压盖玻片5分钟,确保胶体液铺展
7. 放进4℃冰箱里备用
二、 样品准备
实验开始,将基质液(Reagent C)置于微波炉里加热溶化,然后放进45℃恒温水槽备用。然后进行下列操作。
1. 准备1片新鲜的待测叶片
2. 铺平放进60mm细胞培养皿,置于冰槽里(注意:避免直线光照)
3. 加入xx微升预冷的缓冲液(Reagent B)
4. 使用新的洁净的手术刀,轻柔地切割叶片成细丝状或根尖成细块状(注意:避免切成浆液状或粉碎状)
5. 倾斜和平放培养板三次,确保叶片和缓冲液充分混合
6. 移出50微升细胞核分离液(无渣叶片液)到1.5毫升离心管
7. 加入xx微升在45℃恒温水槽里的基质液(Reagent C)
8. 用枪头上下抽吸混匀
9. 用大拇指推动移走上述制备的载玻片上的盖玻片
10. 即刻移取75微升胞核基质混合液到载玻片上
11. 用新的盖玻片盖上
12. 轻压盖玻片5分钟,确保胞核基质混合液铺展
13. 放进4℃冰箱里冷却10分钟,直至胶体凝结,避免光照
14. 用大拇指推动移走上述制备的载玻片上的盖玻片
15. 即刻移取xx微升在45℃恒温水槽里的基质液(Reagent C)到载玻片上胞核基质混合液上面
16. 用新的盖玻片盖上
17. 轻压盖玻片5分钟,确保基质液铺展
18. 放进4℃冰箱里冷却10分钟,直至胶体凝结,避免光照
19. 用大拇指推动移走上述制备的载玻片上的盖玻片
20. 将载玻片放进9cm培养皿
21. 加入xx毫升预冷的裂解液(Reagent D)
22. 放进4℃冰箱里孵育60分钟
23. 抽去裂解液
注意事项
1. 本产品为20次操作
2. 操作时须戴手套
3. 整个操作,建议在暗光下进行
4. 建议使用新鲜植物组织
5. 可以使用8毫摩尔甲磺酸乙脂(ethyl methanesulfonate;EMS)预处理样品作为阳性对照,建议使用植物种子甲磺酸乙脂突变诱导试剂盒-GMS16006
6. 操作时小心轻柔,避免胶体脱位
7. 电泳温度过高,会造成胶体脱位
8. 电泳液(Reagent E): 10倍浓度为3摩尔NaOH,10毫摩尔EDTA,pH 13.5
9. 中和液(Reagent F): 400毫摩尔 Tris,pH 7.5
10. 电泳时,电压25伏为佳,建议控制电泳液量或更换电泳液达到要求
11. 植物组织DNA损伤彗星图像如下
12. 本公司提供系列DNA损伤检测分析试剂产品
原创作者:青岛捷世康生物科技有限公司