分光光度法 50 管/48 样

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶。GSH-Px

不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与 ROS 反应，生成氧化型谷胱甘肽 GSSG，从而保护

生物膜免受 ROS 的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮

抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理：

GSH-Px 催化 H₂O₂ 氧化 GSH，产生 GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化 NADPH 还原 GSSG，

再生 GSH，同时 NADPH 氧化生成 NADP⁺；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而 NADP⁺

没有；通过测定 340 nm 光吸收减少速率来计算 GSH-Px 活性。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，室温保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 20μL×1 支，-20℃保存。

混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一 40 mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三，

混匀。（注意：必须现配现用，当天使用完）

试剂四：液体 5.1mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，

加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建

议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7

秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

测定操作：

1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 混合试剂在 25℃或者 37℃（哺乳动物）水浴中预热 30min。

3. 测定管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 试剂四、800μL 预热的混合试剂、100μL

上清液， 迅速混匀后于 340nm 处测定第 10 s 和第 190s 的吸光值，分别记为 A 测 1 和 A 测

2，△A 测定管= A 测 1﹣A 测 2。

计算公式：

(1). 按蛋白浓度计算

GSH-Px 活力单位定义：一定温度中，每 mg 蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶

活单位。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（Cpr×V 样）÷T

=536×△A 测定管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

GSH-Px 活力单位定义：一定温度中，每 g 样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活

单位。

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