过氧化物酶标记抗体技术交流展开

过氧化物酶标记抗体，是一类广泛用于免疫学、分子生物学及临床医学的各个分支学科中的特异、敏感和安全的免疫化学制剂。目前较为常用的是将辣根过氧化物酶（HRP），经过碘酸钠氧化而标记在抗体IgG分子上，而制成HRP-抗体结合物。

本公司向用户提供的各类酶标物，均根据本公司建立的改良过碘酸钠氧化法标记而成。每种成品已加入一定浓度的BSA作为稳定剂。产品的工作浓度根据

方法不同而别，产品需-20℃冻存，避免反复冻融。

本产品每0.1ml液体含有HRP约200ug/支，IgG约含400ug/支，BSA300ug/支。本品可4℃保存约3～6个月，稀释后4℃可保存30天左右。稀释液为：PBS（pH7.4）。

产品应用范围：

抗原决定簇的抗原性分析鉴定，各种抗原、抗体的定量、定性及定位分

析测定等。

HRP标记抗体具体方法

酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

　　戊二醛二步法

　　1.　原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

2.　标记步骤：

　　（1）　称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

　　（2）　反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。

　　（3）　将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

　　（4）　用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。

　　（5）　加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

　　（6）　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。

　　（7）　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

　　（8）　将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

3.　结果判定：

　　（1）　定性及效价滴定：用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法（或在正式实验系统里）对酶结合物进行滴定（ 见本节 （三）工作浓度的选择）。

（2）　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定（光程1cm）。

　　酶量（mg／ml）＝OD403nm×0.4

　　IgG量（mg／ml）＝OD280nm-OD403nm×0.42）×0.94×0.62

　　　　　　　　　酶量（mg／ml）　　 IgG量（mg／ml） 　　酶量

　　克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4

　　　　　　　　　　40,000 　　　　　　160,000　　　IgG量

　　（3）　本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。

4.　试剂及器材：

　　（1）　0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水（PBS）：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。

　　（2）　1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。

　　（3）　1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。

　　（4）　0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。

　（5）　0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。

　　（6）　PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。

　　（7）　萘氏试剂及聚乙二醇（PEG，MW2000）。

　　（8）　纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。

　　（9）　HRP（RZ>3.0）。

　　（10） Sephadex G-25层析柱（2cm×50cm）。

　　（11） 搅拌器，分光光度计，离心机。

　　（12） 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。

上海劲马生物种类包含：1.人ELISA检测试剂盒； 2.动物ELISA检测试剂盒；3.植物ELISA检测试剂盒； 4.食品ELISA检测试剂盒；5.农产品ELISA检测试剂盒；6.微生物细胞ELISA检测试剂盒；7.其他各类ELISA检测试剂盒

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