联系我们
联系人：钱经理
技术文章
elisa实验中关于显色问题的解析
点击次数：4356 发布时间：2015/4/17 10:13:37
商家名片
钱**
联系我时，请说明是阿仪网看到的，谢谢!
- 电话: 02*******073
- 手机: 18******311
- 微信:
- 交换名片后展示联系方式 → →
ELISA是免疫学检测、诊断研究最常用的方法之一，对于ELISA的检测原理、操作规程都有明确的文献可供参考。ELISA结果判断一般是根据显色底物的显色深浅进行的。显色反应仍要求在37 ℃下进行，约需10分钟，然后用终止液终止显色反应，并用酶标仪检测特定波长下的吸光度。由于酶标仪对各反应孔的检测光路是垂直方向的，因此在进行检测 时，应保持各反应孔孔底的整洁；同时，显色底物、终止液的量也应该准确，因为孔内液体的量将影响到最后的读数，以下是Elisa实验中显色问题影响结果的解决办法，欢迎阅读赏析。
所有检测孔均无色
原因可能为酶结合物或底物失效、底物漏加（错加）、阳性对照漏加或错加，其中以酶结合物失效和底物错加为常见。查找原因的方法是将酶结合物与底物直接混合，观察有无显色；如显色则提示为阳性对照漏加或底物错加所致；若不显色，用新酶结合物与底物混合，观察有无显色；不显色则提示底物失效，显色提示原用酶结合物失效。在确定底物错加或失效者，若来加终止液。可重新洗板再显色。
所有检测孔均显色
原因多为洗板不净（扎内残留未结合的酶结合物）或显色时间过长。洗板是elisa检测重要环节．应严格按说明书进行，可以适当延长浸泡时间、增加洗涤次数ｌ～２次，否则极易导致假阳性（竞争抑制法为假阴性）结果。
质控孔无色
一般为酶结合物活性降低所致（排除底物错加、失效及漏加质控物）。质控物一般为临界值的，是确定试验成功与否的重要依据。阳性对照虽然显色，但可以发现其吸光度变化较大，该批试验须重作，防止弱阳性结果的漏检。
底物有颜色
目前国产elisa试剂盒的色原底物常为Ａ、B两种液体，分别为一定浓度的双氧水和四甲基联苯胺（TMB）或邻苯二胺（OPD）溶液，他们都不稳定，使用保存不当易产生颜色；在使用时发现有颜色（或各取一滴混合后显色），说明他们变质或已受污染，必须丢弃。
ELISA实验常见问题分析
| 异常 | 结果描述 | 原因分析 | 对策 |
| 白板 | 显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。 | 试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用 | 检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。 |
| 错加、漏加试剂底物、显色剂 A或B | 严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。 | ||
| 洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力 | 确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净。 | ||
| 终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制 | 每次配制时都应看清标签标明物质 | ||
| 蒸馏水有问题 | 确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸馏水比较。 | ||
| 显色弱、灵敏度低 | 实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。 | 试剂盒超过期， 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号； 试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响； | 实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。 不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。 |
| 试剂、样品用前未平衡至室温 | 从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡 20分钟左右。 | ||
| 加入试剂的体积和时间有误， 移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁； | 确定所使用的试剂体积正确，加入时间适当。 校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全。 | ||
| 洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力 | 确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。 | ||
| 孵育时间及孵育温度未达到要求 ，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。 | 孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。 保温期内不宜多开门，以免影响保温。 | ||
| 洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求；洗涤冲击力太大。浸泡时间太长； | 严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。 | ||
| 显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入； | 显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂 A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入 | ||
| 底物作用时间不够； | 准确定时。 | ||
| 蒸馏水水质有问题； | 测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。 | ||
| 实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱 | 待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的 | 如有怀疑，可复检 | |
| 标本加入叠氮钠作为防腐剂 | 酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用 proclin、硫柳汞等其他防腐剂 | ||
| 阴阳性对照正常，但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。 | 未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但 质控或弱阳性标本受 温度变化影响较大而被未检出 | 质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的，可存于 2-8℃，如需长期保存，应置于-20℃以下保存。质控品应小量分装，并置于-20℃以下保存。 | |
| 质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴度下降，而未能检出 | 重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。 | ||
| 仪器设定不正确，滤光片不匹配 | 重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配 |
试剂盒的贮藏应按说明书的要求，在elisa检测中应严格按照elisa的操作规则执行，避免elisa检测中的常见实验问题。
原创作者：上海劲马实验设备有限公司
